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[期刊] 中国水产科学
[作者]
翟立文 刘文枝 许晨 范玉顶 江南 周勇 曾令兵
本研究针对鲤浮肿病病毒(carp edema virus, CEV)基因组核蛋白编码基因P4a的序列,设计2对特异性引物,以克隆构建的重组质粒为标准模板,通过优化反应体系中引物浓度组合、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、反应温度和扩增时间等参数,建立了CEV环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。结果表明,CEV-LAMP方法的最佳反应温度为62℃,引物浓度组合为引物F3/B3 0.2μmol/L,引物FIP/BIP 1.2μmol/L, Betaine0.7 mol/L, Mg~(2+) 8.0 mmol/L, dNTPs 1.2 mmol/L,反应时间60 min。反应产物经凝胶电泳呈现梯型条带,添加SYBR Green I荧光染料后,呈现明显的绿色阳性反应。CEV-LAMP法灵敏度高,最低检测限为10 copies/μL,较常规PCR法灵敏度高100倍; CEV-LAMP法特异性强,与锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)、鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)无交叉反应。CEV-LAMP应用于患病鲤样本检测结果准确,简便快速,可为鲤浮肿病的现场诊断与防控提供技术支撑。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李琼 岳志芹 凌宗帅 刘荭 梁成珠 陈晓 陈昌福
根据淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因保守序列,利用PrimerExplorer 3软件设计了5条引物,对LAMP反应温度和反应时间等参数进行了优化。与流行性造血器官坏死病毒、虎纹蛙病毒、蛙虹彩病毒、新加坡石斑虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒等其它虹彩病毒及对虾白斑综合症病毒都没有交叉反应。将LAMP检测方法与常规PCR进行灵敏度的比较分析,结果显示LAMP的检测灵敏度约为15 fg,比常规PCR灵敏度高一个数量级。该方法检测时间短,在1 h内即可完成检测。用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明12尾外观有淋巴囊肿病症状的...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张金凤 曾令兵 张辉 周勇 肖艺 苏岚 高正勇
根据草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)衣壳蛋白VP6编码基因的序列设计特异性引物,以病毒全基因组RNA为模板,通过对反应条件进行优化,建立了GCRV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。检测结果表明,本方法可在63℃下1 h内实现靶片段的大量扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯型条带,反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色阳性结果明显区别于橙色阴性结果。该检测体系针对草鱼呼肠孤病毒的检测灵敏度高,其最低检测限为33 pg,与常规RT-PCR方法相比较,灵敏度高10倍,且与斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
孙颖杰 岳志芹 刘荭 赵玉然 史秀杰 梁成珠 吴斌 李叶 王哲
建立了牙鲆弹状病毒的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,首先根据牙鲆弹状病毒的糖蛋白的基因保守序列,利用Primer Explorer V3软件设计了6条引物,并对LAMP反应温度和反应时间等条件进行了优化。该方法的检测限为30fgRNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与鲤春血症病毒、传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、海洋双RNA病毒、病毒性出血败血症病毒以及病毒性神经坏死病毒等没有交叉反应。该方法检测时间短,在1h内即可完成检测。用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明40尾石鲽鱼样品中有...
[期刊] 水产学报
[作者]
曲朋 王崇明 任伟成 梁彦韬 贾志磊 黄倢 潘鲁青
奥尔森帕金虫是重要的贝类病原性寄生虫之一,为建立快速、灵敏、准确和使用简便的检测方法,实验根据奥尔森帕金虫5.8S rDNA中的内转录间隔区(internal transcribedspacer,ITS)序列,建立了环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对反应温度、反应体系中Mg2+浓度和反应时间进行了优化。该方法的检测灵敏度约为30拷贝质粒DNA,并且特异性较强,与海水帕金虫、包纳米虫、波豆虫及急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)等病原均无交叉反应。使用LAMP法对两...
[期刊] 水产学报
[作者]
何琳 徐海圣 王美珍 戎华南
根据对虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因保守序列,利用Primer Explorerv 4.0软件设计了4条引物,建立了白斑综合征病毒环介导等温扩增快速检测方法,对反应温度和反应时间等参数进行了优化,同时将建立的LAMP检测方法与巢式PCR进行了比较分析。结果表明,LAMP最适反应在64℃恒温条件60min内完成,凝胶电泳呈现梯型条带;反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色的阳性结果明显区别于橙色阴性结果。LAMP方法的最低检出限为100拷贝/μL,灵敏度较巢式PCR高100倍,而且LAMP方法在1h内即可完成检测,操作简单,无需复杂仪器,肉眼可直接观察检测结果。...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
何亚鹏 陈怡静 时晓 张宝莉 温战华 陈春山 李博 杜迎春
实验建立了一套反转录环介导等温扩增方法(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP),用于实验室及现场检测鲑鳟鱼传染性造血器官坏死病毒(infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)。针对IHNV的核蛋白基因设计特异性引物,以IHNV基因组RNA为模板,在反转录酶及Bst DNA聚合酶的作用下进行反转录LAMP,结果阳性样本表现为荧光绿色,阴性样本仍为红棕色。反应条件优化结果表明最适反应温度为64℃;特异性试验表明仅IHNV发生特异性扩增,而SVCV、HRV、VHSV和H_2O均不发生反应;敏感性试验表明该LAMP方法可检出浓度为1.0×10~(-4)μg/μL的IHNV核酸。本研究所建立的IHNV反转录LAMP检测法成本低、操作简单、反应迅速、不依赖专门的仪器,同时具有较高的灵敏度和特异性,适合IHNV的现场检测和大批量样品的检疫。
[期刊] 水产学报
[作者]
李聪慧 徐进 刘文枝 周勇 曾令兵
为建立一种操作简单、结果准确可靠、结果判定直观、成本低廉的现场快速检测方法,为锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus,KHV)疾病的防控提供技术支撑,根据KHV保守的DNA聚合酶(DNA polymerase,Sph)基因,设计一组单交叉扩增引物,以构建的Sph基因重组质粒作为标准DNA模板,采用单交叉引物等温扩增技术(single cross priming amplification,SCPA)进行扩增,优化反应体系的引物浓度组合、Mg2+浓度、d NTPs浓度、反应温度和时间,并结合核酸试纸条技术(nucleic acid test strip detection method)...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
施少华 陈红梅 程龙飞 傅光华 万春和 黄瑜
以禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)C48-1为研究对象,利用LAMP方法对Pm进行快速检测.结果表明:LAMP方法在恒温65℃下,1 h内就可以检测到Pm;LAMP方法最低可检测100 pg.μL-1Pm基因组DNA.该方法不需要精密的温度循环装置,有恒温加热设备就可以满足检测条件,适合基层临床应用.
关键词：
禽多杀性巴氏杆菌 环介导等温扩增方法
[期刊] 淡水渔业
[作者]
张旻 王娜 景宏丽 吴绍强
为提高草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)的检测效率,根据GCRV-873株VP5基因片段,设计了2对特异性引物,建立了检测GCRV-873株的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。结果显示:该方法使用25μL反应体系,经优化后的反应温度为65℃,反应时间1 h,检测限可达10个拷贝数的病毒核酸,比传统的RT-PCR方法要高10倍。且不与鲤春病毒、传染性造血器官坏死病病毒、传染性胰脏坏死病毒和病毒性出血性败血症病毒RNA产生交叉反应。在反应体系中加入染料后,反应结果肉眼直接可见,是一种特异性强、方便快捷的检测方法,适合GCRV-873株的现场初筛和核酸检测工作。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘佳 黄丛林 吴忠义 张秀海 王永勤
【目的】环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术。本研究拟用该技术建立菊花中番茄不孕病毒(TAV)的检测方法。【方法】设计能识别TAV CP序列6个特定区域的4种LAMP特异引物,对MgCl2、dNTPs、甜菜碱等LAMP反应条件进行优化,利用新建的LAMP法检测TAV,比较LAMP和RT-PCR2种不同方法的检测灵敏度。【结果】建立了检测番茄不孕病毒的LAMP技术;LAMP比RT-PCR具有灵敏度更高、快速、简便等优点。【结论】建立的LAMP技术能快速、准确、简便地检测出菊花中的番茄不孕病...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
史秀杰 于力 王津津 何俊强 郑晓聪 贾鹏 兰文升 杨锦舜 刘荭
根据ISAV的基因保守序列,利用LAMP Designer软件设计了6条引物,采用新型的环介导等温扩增设备进行扩增和检测,优化了反应条件,分析了所建立方法的特异性和灵敏度,并与RT-PCR和实时荧光RT-PCR进行比较。研究表明,该方法最适反应温度为64℃,反应10 min就可以观察到明显的扩增。该方法灵敏度高,检测限为78.4 fg RNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与实时荧光定量RT-PCR灵敏度相当;特异性好,与传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、出血性败血症病毒(VHSV)、鱼类病毒性神经坏死病病毒(VNNV)、鱼腹水病毒(YAV)等14种主要鱼类病...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘星彤 林柏荣 廖金铃 卓侃
为了快速、简便、准确地检测重要植物病原线虫—最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus),依据GenBank中短体线虫的线粒体DNA细胞色素氧化酶I(mtDNA COI)序列,设计了扩增最短尾短体线虫的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物,并对LAMP反应条件进行优化,成功建立了一种可特异、快速检测最短尾短体线虫的LAMP体系。该体系在64℃下反应60min,扩增效率最高。用琼脂糖凝胶电泳、酶切分析和SYBR Green Ⅰ染色均能特异检测到最短尾短体线虫的扩增产物。所建立的LAMP体系能从供试的9种短体线虫和另外10种植物线虫中特异检测出最短尾短体线虫,其灵敏度可检测到1/200条线虫DNA,是常规PCR的10倍。表明本研究建立的最短尾短体线虫的LAMP检测体系,可用于最短尾短体线虫的快速检测。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
席伟军 李江红 陈大福 梁勤
【目的】建立一种快速、灵敏的检测蜜蜂球囊菌（ＡｓｃｏｓｐｈＡｅｒＡ Ａｐｉｓ）的环介导等温扩增（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉＡｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍＡｌ ＡｍｐｌｉｆｉｃＡｔｉｏｎ，ｌＡｍｐ）方法，为监测和防治蜜蜂白垩病提供技术支撑。［方法］根据蜜蜂球囊菌特异性序列ｉｔｓ区，用在线引物设计软件ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ４．０设计并合成４条特异性引物Ａ．Ａｐｉｓ－ｆ３（５＇－ＡｃＡｔｔＧｃＧｃｃｃｔｃｔＧＧｔＡ－３＇）、Ａ．Ａｐｉｓ－Ｂ３（５＇－ｔＧＧｔｔＡＧＡｃｃＧＧＡｃＡＧｔｃＧ－３＇）、Ａ．Ａｐｉｓ－ｆｉｐ（５＇－ｔＡＡＧＡｃＧＧＧＡｃＧＡｔｃＧｃｃｃ ＡＡｃｃｔＧｔｃｃＧＡＧｃＧｔｃＡｔｔ．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
许紫建 杨兵 苏霞 周宏专 史爱华 徐福洲
首先根据空肠弯曲菌mapA基因序列设计LAMP引物,建立检测空肠弯曲菌的LAMP检测方法。继而对LAMP方法中不同反应组分的浓度分别进行筛选,结果显示,当内外引物浓度分别为1.6,0.2μmol/L、Mg2+浓度为8mmol/L、dNTP浓度为1.4 mmol/L、Betaine浓度为0.8 mol/L时获得最佳的反应结果。最后对LAMP反应的特异性和敏感性进行检测,特异性检测结果显示,对其他13种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌扩增结果均为阴性;敏感性检测结果显示,对空肠弯曲菌基因组DNA的检测限为每个反应管100 fg,对空肠弯曲菌培养菌液检测限为每个反应管7.5cfu。试验建立的LAMP方法为...
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