为了揭示鲤春病毒血症病毒（ｓｐｒｉｎｇ ｖｉｒｅｍｉａ ｏｆ ｃａｒｐ ｖｉｒｕｓ，ｓｖｃｖ）糖蛋白编码基因的主要免疫原性决定区域，本研究对ｓｖｃｖ的糖蛋白基因进行截短表达，并用纯化的重组蛋白作为免疫原制备了兔抗血清以分析其免疫原性。通过ｓｏｓｕｉ以及Ｄｎａｓｔａｒ ６．０软件对ｓｖｃｖ糖蛋白基因的跨膜区、亲水性以及抗原表位进行分析后，采用ｒｔ－ｐｃｒ对该基因主要抗原决定区域编码片段进行扩增，并构建重组表达质粒ｐ ｇｅＸ－ｇｔｒ，对其进行诱导表达后获得截短的ｓｖｃｖ糖蛋白的重组蛋白。将表达的重组蛋白进行纯化复性后，作为免疫原制备兔抗血清，采用ｅＬｉｓａ法检测其效价，采用免疫印迹以及间接免疫荧光．．．

鲤春病毒血症病毒(SVCV)能够引起鲤科鱼类大量死亡,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的重要疫病,也是我国唯一被列为一类疫病的鱼类传染病。为建立SVCV的快速免疫学诊断方法,研究其主要结构蛋白间的免疫原性差异,实验首先采用原核表达系统克隆并诱导表达,纯化SVCV的核蛋白(N)、磷蛋白(P)和基质蛋白(M),并进一步免疫新西兰白兔制备抗血清,抗血清经Protein A柱进一步纯化获得3种蛋白的多克隆抗体。利用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫印迹实验(Western blot)对抗体效价和特异

以鲤春病毒血症病毒(Spring Virernia of Carp Virus,SVCV)shlj1分离株基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增获得SVCV糖蛋白(Glycoprotein,G)部分基因序列(420 bp),克隆至pET-32a原核表达载体,构建重组质粒pET-32a-G;将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta表达菌株,利用SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)对截短G蛋白的表达及纯化情况进行检测;将纯化的G蛋白免疫小鼠制备鼠抗血清,采用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和细胞间接免疫荧光抗体试验(Indirect fluorescent antibody test,IFAT)对抗血清进行鉴定。SDS-PAGE结果显示该重组截短G蛋白与预期大小相符(约为35 kDa),以包涵体的形式表达;ELISA结果显示,制备的鼠抗截短G蛋白血清效价为1∶80 000;IFAT结果显示,抗血清能够识别不同地区的SVCV分离株(黑龙江省3株,辽宁省2株),在FITC标记的羊抗鼠IgG作用下,呈特异性绿色荧光。结果表明,制备的截短SVCV G蛋白具有良好的免疫原性,利用其所制备的抗体能够识别我国不同SVCV分离株病毒表面天然结构的糖蛋白。

根据Gen Bank中鲤春病毒血症病毒(SVCV)糖蛋白全基因序列设计特异性引物,以SVCV欧洲株病毒核酸为模板,通过RT-PCR方法获得欧洲株SVCV-G基因,克隆至p PICZαA,构建p PICZαASVCV1540表达质粒。以限制性内切酶Sac I线性化p PICZαASVCV1540后通过化学法转化毕赤酵母感受态细胞X33和GS115,添加1%甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物显示其分子质量为70 ku。Western Blot分析显示该蛋白可以被SVCV山羊多抗识别,表明目的蛋白具有反应原性。

根据SVCV糖蛋白基因序列设计引物,在5’引物和3’引物中分别引入酶切位点。以病毒核酸为模板用RT-PCR方法扩增该段糖蛋白基因,将所得的基因片段(517和521)克隆至穿梭载体pGAPZαA/B之GAP启动子下游位点,构建含α信号肽的重组表达载体。获得的重组质粒pGAPZαA-517和pGAPZαB-521经线性化后,电击法转化毕赤酵母SMD1168菌株,构建分泌型表达SVCV糖蛋白的重组酵母菌株。酵母菌落PCR法检测表明,已成功构建分泌表达SVCV糖蛋白的酵母基因工程菌株,斑点印迹法进一步分析表明有目的蛋白的成功表达。

根据鲤春病毒血症病毒(SVCV)基因组序列(GenBank:NC_002803),人工合成M基因开放阅读框序列,克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化工程菌株BL21(DE3),在0.1 mmol.L-1 IPTG、37℃下诱导5 h,获得高效表达的M蛋白,但其主要以包涵体的形式存在,经超声破碎、包涵体纯化后,再经Ni亲和层析柱纯化,获得高纯度的M蛋白.以纯化的M蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备了M蛋白的多克隆抗血清.ELISA检测显示抗血清的效价达1∶128000;western blot分析显示抗血清能够识别SVCV的M蛋白,表明其具有较好的灵敏性和特异性.

【目的】克隆鲤鱼春季病毒血症病毒(SVCV)的磷蛋白(P蛋白)基因,并对其进行原核表达,为进一步制备SVCV P蛋白单克隆抗体及建立新的SVCV诊断方法奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增SVCV P蛋白基因,将其克隆入pET-28a(+)载体中,获得原核重组表达质粒pET28-P,进行原核表达。将该重组原核表达质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中,用0.4mmol/L IPTG进行诱导表达,用镍亲和层析试剂盒对表达产物进行纯化,分别用SDS-PAGE和Western Blotting方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了SVCV P蛋白基因,该基因长度为933bp。成功构建...

为研制禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)亚单位疫苗,本研究对FAdV-4的Fiber-2蛋白在毕赤酵母中的发酵工艺进行了优化。首先根据酵母密码子偏好性优化Fiber-2基因,并且构建了重组真核表达载体pPIC9K-Fiber-2。将该质粒转化至毕赤酵母GS115菌株,经不同质量浓度G418筛选获得高拷贝重组菌。随后在摇瓶中进行诱导发酵时温度、时间和甲醇浓度的优化。用优化后的条件进行发酵表达并将上清液通过镍柱纯化得到了重组的Fiber-2蛋白。最后将蛋白与ISA-201-VG油佐剂混合并免疫21日龄SPF鸡进行免疫保护性试验。结果表明:在毕赤酵母中成功且高效的分泌表达了Fiber-2蛋白,分子量约为60ku,在摇瓶发酵中诱导的最佳甲醇浓度、时间和温度分别为1.0%、72h和30℃。优化后发酵液上清中的总蛋白量约为50mg/L,重组Fiber-2蛋白达到8.7mg/L。SDS-PAGE和Western blot结果表明采用镍柱对蛋白进行纯化可得到条带单一且具有良好免疫原性的重组Fiber-2蛋白。免疫保护性试验显示,由优化后的毕赤酵母表达Fiber-2蛋白制备的亚单位疫苗免疫雏鸡后,可以诱导较高的抗体水平并提供高达100%的超强FAdV-4毒株(GD616)的攻击保护。本研究为进一步采用毕赤酵母表达的重组Fiber-2蛋白制备FAdV-4亚单位疫苗的研发奠定了基础。

为了获得具有良好免疫活性的基因工程抗原蛋白，利用毕赤酵母真核表达系统，表达猪传染性胃肠炎（河北分离株）的纤突糖蛋白。根据Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＴＧｅＶ Ｓ基因设计一对引物，经ＰＣＲ扩增出长２．２ ｋＢ的目的基因Ｓ，将Ｓ基因亚克隆于Ｐ ＰＩＣ９ｋ载体，转化ＴＯＰ１０感受态，ＰＣＲ、酶切鉴定阳性克隆，ＳａｌⅠ线性化重组穿梭质粒ＰＰＩＣ９ｋ－Ｓ，然后电转ＧＳ１１５感受态，利用Ｇ４１８抗性进行多拷贝整合子初步筛选，提取基因组并做ＰＣＲ鉴定，得到阳性菌株，经诱导发酵后，上清发酵液经ＳＤＳ－ＰａＧｅ电泳检测，显示获得分子量为８２ ｋＤａ左右的目的蛋白，同时用ＷｅＳＴｅＲｎ－ＢｌＯＴＴＩｎＧ检测到一条特异的目的．．．

将SARS冠状病毒(SARS-CoV)表面的主要结构蛋白刺突蛋白S144-643的基因片段(nt430-nt1929)克隆入表达质粒pET-28b中,并在大肠杆菌中表达。S144-643蛋白分子质量为55 ku左右,以包涵体形式存在于细菌中。ELISA及Western blot证明,S144-643可以与SARS康复病人的阳性血清发生特异性反应,免疫新西兰大白兔可以诱发产生较高水平的特异性抗体,因而证明原核表达的S144-643具有良好的免疫原性。

鲤春病毒血症病毒(SVCV)是一种能够引起鲤科鱼类急性传染性病毒病-鲤春病毒血症(SVC)的病原,一旦暴发会造成巨大的经济损失。该病主要在欧洲的鲤鱼养殖中广泛传播,主要症状为体内出血,腹膜炎及腹水。SVCV具有囊膜,暂时列为弹状病毒科水泡性病毒属。病毒基因组为线性单股不分段的负链RNA,长11 019个核苷酸,主要包含5个基因,分别编码核蛋白N、磷蛋白P、基质蛋白M、糖蛋白G和RNA聚合酶L。目前,中国出入境检验检疫检测SVCV的行业标准是逆转录PCR法。本研究从病毒的生物学特征,感染的临床症状及流行特点,病毒基因组及其多肽特征,病毒的分类地位以及检测技术等方面对国内外研究的现状作一综述,以期...

【目的】克隆传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)CJ-13株糖蛋白(G蛋白)基因,构建原核表达载体,并检测其在大肠杆菌BL21中的表达情况,为IHNV诊断试剂盒和疫苗的研制奠定基础。【方法】设计1对G基因特异引物对G基因进行RT-PCR扩增,将扩增产物克隆到pGEM-T Easy载体上,构建重组质粒pGEM-T Easy-G,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将G基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,构建传染性造血器官坏死病病毒G基因原核表达质粒pET-32a-G,转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法对表达产物进行分...

为了鉴定CyHV-2的主要免疫原性蛋白，本研究用分离的CyHV-2-YC-1分离株感染异育银鲫尾鳍细胞系（GiCF），用蔗糖密度梯度超速离心法对细胞感染液中的CyHV-2进行纯化，纯化后的CyHV-2病毒免疫小鼠制备抗CyHV-2多克隆抗体。纯化的病毒颗粒经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色后，用抗CyHV-2多克隆抗体进行Western blotting分析和质谱鉴定。结果显示，透射电镜观察下发现50%～66%的蔗糖梯度多见完整囊膜包裹的CyHV-2病毒颗粒，也有少量囊膜破损的病毒颗粒。Western blotting结果显示，抗CyHV-2多克隆抗体与多种病毒蛋白具有特异性免疫反应，质谱鉴定显示，其中8种主要免疫原性蛋白分别是ORF92、ORF115、ORF25、ORF57、ORF66、ORF72、ORF131和ORF132。研究表明，通过蔗糖密度梯度超速离心法提纯CyHV-2病毒颗粒后，本研究制备的抗CyHV-2多克隆抗体能够特异性识别CyHV-2病毒的主要免疫原性蛋白。本研究将为CyHV-2免疫学检测方法的建立以及疫苗的研制提供更多的候选抗原。

【目的】在昆虫细胞中表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S1-NTD蛋白,研究其免疫原性,为基于PEDV S蛋白的基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。【方法】PCR扩增PEDV S1-NTD基因,构建其重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD和重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD。将Ac-PEDV S1-NTD转染sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。将P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,Western blot鉴定重组蛋白的表达,空斑试验测定重组杆状病毒的滴度。在此基础上,分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1,1和3的P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,并在感染后1,2,3,4和5 d收集细胞,通过Western blot和空斑试验分别检测目的蛋白的表达量和重组杆状病毒的增殖情况。将MOI为0.1的P3代重组杆状病毒皮下注射免疫BALB/c小鼠,每隔2周免疫1次,共免疫3次,以注射PBS、空载体Bacmid和PEDV商业疫苗为对照组,于首免后不同时间采集血液分离其血清,ELISA法检测血清中PEDV特异性抗体的水平;于首免后35 d剖取小鼠脾脏,分离其淋巴细胞;PEDV刺激后,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖情况。【结果】PCR扩增获得了约738 bp的PEDV S1-NTD基因;成功构建了重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD、重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD和重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。利用杆状病毒表达系统在sf9细胞内成功表达了重组PEDV S1-NTD蛋白,且杆状病毒以MOI为1感染sf 9细胞后在第3天蛋白表达量达到最高。在首免后35 d,重组杆状病毒免疫组小鼠血清效价达到最高值,为1∶5 000,与商业疫苗组效价一致;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD免疫组小鼠脾淋巴细胞对PEDV的刺激也发生了显著增殖(P0.05)。【结论】成功构建了重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD,在昆虫细胞中成功表达了PEDV S1-NTD蛋白,且具有较好的免疫原性。