采用RACE-PCR方法,从鲢(Hypophthalmichthys molitrix)头肾SMARTcDNA中获得了679 bp IL-8 cDNA序列。结果显示:该序列包含169 bp的5′非编码区,213 bp 3′端非编码区和297 bp的开放阅读框;鲢IL-8的开放阅读框编码98个氨基酸残基,其中包含构成两对二硫键的4个保守半胱氨酸。RT-PCR结果显示鲢:IL-8 mRNA主要在胰、肝脏和头肾中表达。将鲢IL-8不含信号肽的成熟多肽克隆到原核融合表达载体pQE30上,转入大肠杆菌M15内进行表达,经SDS-PAGE电泳后显示,重组融合蛋白在分子量约11kD处有一明显表达带,与预期计...

IL-8是最早发现的趋化因子,属于CXC亚家族,与鱼类非特异性免疫水平关系密切。实验采用同源克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)方法,从淇河鲫总RNA反转录产物中获得了641 bp IL-8cDNA序列,其中包含102 bp的5'非编码区,242 bp的3'非编码区和297 bp的开放阅读框。该基因编码由98个氨基酸残基组成的前体蛋白,前22个氨基酸残基为信号肽。肽链中含有4个保守半胱氨酸,前2个半胱氨酸被1个精氨酸分隔,形成CXC结构。第一个半胱氨酸前缺乏ELR基序,其组成是DPR。由氨基酸同源性分析和进化分析可知,淇河鲫IL-8与鲤、鳙、草鱼、鲢等鲤科鱼类的进化关系较近,与鲤IL-8的同...

白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)作为炎症反应的关键介导物,通过开启基因的表达来调控免疫反应。为了丰富鱼类该基因的研究,实验采用RT-PCR和RACE-PCR技术,首次从鲇形目鱼类大鳍鳠中获得IL-1β基因cDNA的全序列。大鳍鳠IL-1β基因cDNA全长1 194 bp,包括3'非编码区域(UTR)为224 bp,5'UTR为82 bp,开放阅读框(ORF)为888 bp,编码296个氨基酸。预测的蛋白质分子量为33.843 43 ku,等电点为5.00。与斑点叉尾等其他8种脊椎动物进行同源性分析发现,大鳍鳠IL-1β氨基酸序列与斑点叉尾相似性最高,为79.0%,与原...

为揭示淇河鲫(Carassius auratus var.Qihe)白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)的功能,本研究构建了原核表达系统,并制备了兔抗鲫IL-8多克隆抗体。首先采用RT-PCR法扩增淇河鲫IL-8基因编码序列中不含信号肽的基因片段,克隆到pET-32a(+)载体后转化入Rosetta菌株构建原核表达系统。经IPTG诱导表达出相对分子质量约27.8 kD的目标融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,效价达1︰105。经免疫亲和层析纯化的抗体能特异性识别重组和天然的

【目的】克隆鲢胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)基因,分析其编码蛋白的结构与功能,并分析低氧胁迫下该基因在鲢肝脏中的表达情况。【方法】采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNAends,RACE)扩增鲢IGFBP-1基因的全长cDNA,通过半定量RT-PCR法对鲢肌肉、心脏、脑、肾脏、肝脏、腮和脾等组织器官IGFBP-1mRNA的表达水平进行检测,利用Real-time PCR法检测急性低氧胁迫0,2,4,6,8,10和12h后鲢肝脏组织中IGFBP-1表达量的变化。【结果】鲢IGFBP-1全长cDNA为1 081bp,具有73bp的5′非编...

利用数据库资源和RT–PCR技术获得烟草WRKY8基因,序列分析表明,该基因包含1 551 bp的开放阅读框,编码516个氨基酸。基因编码的蛋白含有2个WRKY结构域,其锌指结构类型为C2H2(C–X4–5–C–X22–23–H–X1–H)。推测其可能定位于细胞核并具有复制转录及调控的功能,从而参与对植物生长发育和胁迫应答的调节。RT–PCR结果表明,NtWRKY8基因受低温诱导表达。

补体系统经活化形成末端补体复合物,C7是将此复合物与目的细胞的细胞膜结合的重要分子。本研究从已有的cDNA文库中克隆鲢(Hypophthalmichthys molitrix)补体C7的cDNA,其全长2 625 bp,编码821个氨基酸。同源性分析表明,鲢补体C7与草鲤鱼的氨基酸序列相同率最高(为93%)。与已报道的硬骨鱼类补体C7相同,鲢补体C7具有一些保守的结构,如TSP1、LDLRa、MACPF、EGF、TSP1、CCP。对12尾鲢补体C7进行遗传多样性分析发现有6个突变位点,其中5个是同义突变,另外一个是非同义突变,确定6个等位基因。在鲢正常组织和嗜水气单胞菌感染的免疫器官组织中,对...

为深入研究胡杨的抗盐分子机制,并获得与之相关的抗逆基因,采用SMART技术构建了胡杨盐胁迫处理cDNA文库。经随机测序,得到一个编号为SSL061的EST序列,与欧美杨的脱水素基因有较高相似性,通过PCR快速扩增文库的方法获得了胡杨脱水素基因(Pedhn)。分析表明,该cDNA的长度为813 bp,拥有681 bp的开放读码框,共编码227个氨基酸。该序列包括两个重复的富含赖氨酸的K片段和由7个连续的丝氨酸残基组成的S片段,但是缺乏Y片段。RT-PCR结果表明,胡杨在未受胁迫的情况下脱水素基因的转录水平较低,而随着盐胁迫浓度的升高,脱水素基因的转录水平总体呈上升趋势。

白细胞介素17 (Interleukin-17, IL-17)在炎症和宿主防御中起重要作用。为了解鲤(Cyprinus carpio) IL-17N基因的功能，本实验使用同源搜索和基因克隆的方法在鲤基因组挖掘鉴定到两个IL-17N基因(CcIL-17Na和CcIL-17Nb)，均由TOP3B基因内含子2的互补序列编码。共线性比较显示，除了东方红鳍鲀(Takifugu rubripes)外，在其他已研究的鱼类中，与该基因相邻的均为SDF2L和PPM1F基因。两个CcIL-17Ns都有3个外显子，编码136个氨基酸，两者相似性高达为97.1%，CcIL-17Na、CcIL-17Nb和其他硬骨鱼类的IL-17N相似性分别为65.3%～97.1%、64.7%～96.3%，和鲤IL-17家族其他成员的相似性分别为32.9%～51.4%、31.4%～50.7%。鱼类IL-17家族系统树显示7个成员形成6支，其中IL-17A/F1和IL-17A/F3组成一支，其余6个成员单独成支，鲤IL-17N先与鲤科鱼类以94% 置信值聚在一起，然后与鲑鳟鱼类、鳉、东方红鳍鲀和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)等以85%的置信值聚在一起，再与雀鳝(Lepisosteus oculatus)和腔棘鱼(Coelacanth)的IL-17N以95% 置信值聚为一支。实时定量PCR结果显示CcIL-17Ns在受精后0.5 h和12 h的表达量极显著高于受精后25 h、35 h、60 h、120 h及仔鱼阶段的表达量(P<0.01)；CcIL-17Ns在鲤夏花和成鱼脑中的表达量均最高，显著(P<0.05)或极显著(P0.05)。构建原核重组表达载体pMAL-c2X-17N，在大肠杆菌Transetta (DE3)中进行原核表达，使用镍柱纯化获得可溶的IL-17N重组蛋白(MBP-17N)。使用0.1 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL的MBP-17N孵育鲤肾组织8 h，结果显示，不同浓度的MBP-17N均使IL-1β和NF-κB显著上调(P<0.05)。本实验通过分析鲤IL-17Ns的系统发育、测定该基因的时空表达特征，发现嗜水气单胞菌感染后各组织CcIL-17Ns表达上调、原核表达蛋白能引起炎症因子的表达，从而证实了鲤IL-17N参与炎症反应。

[目的]本文旨在克隆‘黄冠梨’钾转运体PbKT8基因,对基因定位及表达特征进行初步分析,为其功能研究提供基础。[方法]从‘黄冠梨’果实中克隆PbKT8基因的cDNA全长序列,利用生物信息学对其同源序列进行分析,构建含GFP载体并通过激光共聚焦显微镜精确定位蛋白位置,实时荧光定量PCR分析不同施钾处理下该基因在果实成熟期的表达特征。[结果]钾转运体PbKT8基因序列全长2 328 bp,编码775个氨基酸,PbKT8蛋白与苹果(Malus domestica)进化关系最相近,同源序列相似性高达99.10%;亚细胞定位结果显示,PbKT8蛋白定位于细胞膜上;PbKT8基因转化酵母突变菌株R5421在低于5 mmol·L~(-1) K~+培养基上恢复生长;qRT-PCR结果表明,PbKT8基因在果实和叶片中相对表达量随施钾水平增加而上升。[结论]PbKT8蛋白定位在质膜上具有转运钾离子的功能,在果实成熟期受高钾响应表达。

克隆鲢转铁蛋白(transferrin,Tf)基因的全长cDNA序列,并对鲢转铁蛋白的组织表达模式、胚胎发育过程中的时序表达模式进行分析。结果显示,该cDNA全长2 365 bp,包含2 025 bp开放阅读框(ORF),编码674个氨基酸。鲢转铁蛋白与草鱼转铁蛋白的同源性高达74%,与人乳铁蛋白同源性最低,为39%,与其他鲤科鱼类转铁蛋白的同源性约65%~73%,与非鲤科鱼类的同源性约43%~50%。系统进化树分析显示,鲢转铁蛋白基因与斑马鱼、草鱼、鲤、鲫等几种鲤科鱼类亲缘关系最近,单独聚为一支。鲢转铁蛋白基因仅在肝脏和脾脏中表达(肝脏中表达量高于脾脏)。在胚胎发育过程中,转铁蛋白基因对原肠...

为探究棉花ROP基因在非生物逆境胁迫及外源激素处理下的表达模式，利用同源克隆的方法获得2个陆地棉(Gossypium hirsutum L.)ROP基因GhROP1和GhROP8,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系，并利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对其组织表达的特异性及不同逆境胁迫和外源激素处理下的表达模式进行分析。结果表明：1)GhROP1和GhROP8基因的开放阅读框(ORF)分别为591和630 bp,各编码197和210个氨基酸，均含有1个保守的RHO结构域。2)多序列比对显示2个GhROPs蛋白均符合ROP蛋白结构特征且与其他物种ROP蛋白具有高度的相似性，聚类分析表明，GhROP1蛋白属于Ⅰ类ROP蛋白，GhROP8蛋白属于Ⅱ类。3)2个GhROPs基因在不同组织中均有表达且存在组织特异性：GhROP1基因在真叶中表达量最高，在根部和茎部表达量较低；GhROP8基因在根部表达量最高，其他组织中均为低表达量。2个GhROPs基因对于干旱、高盐、低温及高温等非生物逆境胁迫和外源脱落酸(ABA)、生长素(IAA)的处理均有响应：2个GhROPs基因表达均受干旱胁迫诱导；GhROP1基因表达受高盐胁迫抑制，而GhROP8基因受高盐胁迫诱导；低温处理下2个GhROPs基因表达均呈先下调后上调趋势；高温处理下GhROP1基因表达均呈先下调后上调趋势，GhROP8基因表达呈先上调后下调再上调趋势；2个GhROPs基因表达均受外源ABA抑制；外源IAA处理下GhROP1基因呈先上调后下调再上调趋势，GhROP8基因表达受外源IAA诱导。综上，GhROP1和GhROP8是参与棉花响应多种逆境胁迫的重要基因。

为挖掘小麦抗逆基因，研究类钙调素基因在植物抗逆反应的分子机制，利用电子克隆结合RT-PCR的方法克隆小麦类钙调素基因TaCML8-A。生物信息学分析显示，该基因的CDS区全长为519 bp,编码172个氨基酸，包含PTZ00184和FRQ1超家族，含有4个EF-hand结构域，其中包含4个钙离子结合位点；编码蛋白质分子质量为18.31 ku,等电点为4.54,属于酸性蛋白质。亚细胞定位结果显示，TaCML8-A蛋白质在细胞核和细胞膜中均有分布。核苷酸序列比对发现，TaCML8-A与水稻OsCML14亲缘关系最近，相似性为79.17%。qRT-PCR结果显示，在盐、渗透和冷胁迫处理中，TaCML8-A基因在小麦地上部分和根中的表达均上升，表明植物可能通过提高TaCML8-A基因的表达来响应盐、渗透和冷胁迫；热激时TaCML8-A基因在根和地上部分分别受到诱导和抑制，从而发挥不同的功能。从小麦中成功克隆出类钙调素基因TaCML8-A,并进行表达分析，初步推测该基因可能参与调控植物的非生物胁迫，其结果可为后续研究其生物学功能提供基础理论支撑。

【目的】克隆甘蔗的Ｓｃ ｃｃＤ８，分析其序列特征并预测其功能，研究在甘蔗不同组织部位、不同胁迫处理条件以及不同生长时间点ＳｃｃｃＤ８的表达情况，为该基因在甘蔗基因工程育种中的应用提供理论支撑。【方法】以ＮｃＢＩ中检索的甘蔗ｃｃＤ８同源片段ＥＳＴ序列为模板设计引物，扩增甘蔗ｃｃＤ８的片段，采用ＲＡｃＥ和ＲＴ－ＰｃＲ技术分别从甘蔗品种新台糖２２号中克隆ｃｃＤ８的５′、３′目的片段和全长ｃＤＮＡ序列，以生物信息学方法对序列进行预测分析，利用ｑＲＴ－ＰｃＲ方法分析ｃｃＤ８在不同组织、不同逆境胁迫条件下和不同生长时间点的表达特性。【结果】克隆获得甘蔗ｃｃＤ８，命名为ＳｃｃｃＤ８，ＧＥＮ ＢＡＮｋ登录号为．．．