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[期刊] 水产学报
[作者]
谷莉 郑玉东 张翔 白昌明 刘金兰 辛鲁生 李晨 王崇明
为精确定位鲍疱疹病毒(HaHV-1)在宿主不同组织器官中的分布，明确HaHV-1的组织亲嗜性和侵染进程，实验基于环介导等温扩增技术(LAMP)和原位杂交技术建立了HaHV-1的原位LAMP检测方法。利用该方法研究了HaHV-1人工感染实验不同时间节点，病毒在杂色鲍主要器官的分布规律和组织亲嗜性。并对已报道的HaHV-1 LAMP扩增引物进行优化，实现对载玻片上原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增，筛选最佳显色时间等原位杂交反应条件，最后通过免疫酶标技术分析HaHV-1在组织样本内的分布情况。结果显示，HaHV-1原位LAMP检测方法最适显色时间为60 min。利用该方法对攻毒后24、36、48、60和72 h,HaHV-1在杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺和腹足神经节4种样本的组织分布情况进行检测和分析。病毒阳性信号最早于36 h出现在腹足神经节，48 h在部分外套膜样本中观察到病毒阳性信号，分布局限于外周神经中。在感染实验后期，病毒阳性信号出现在肝胰腺结缔组织中。病毒阳性信号出现的部位常有大量细胞渗出和浸润，渗出的细胞中可见被病毒感染的血淋巴细胞。本研究建立的HaHV-1原位LAMP检测方法，同步实现了高灵敏度和精确定位的功能。该检测方法适用于病毒感染的确诊、不同组织器官的亲嗜性、病毒侵染途径和致病机理等相关研究。
[期刊] 水产学报
[作者]
李亚楠 白昌明 刘金兰 辛鲁生 李晨 刘莉 黄博闻 魏智薪 王崇明
为建立实现牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在贝类宿主组织中的精确定位方法,基于原位杂交PCR (ISPCR)技术建立了OsHV-1的间接原位杂交PCR (indirect ISPCR)检测方法,并利用该方法对OsHV-1在魁蚶主要器官的分布情况进行了检测和分析。首先选择适合原位杂交PCR的引物,在载玻片上实现对原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增,然后与使用相同引物制作的地高辛标记核酸探针进行原位杂交,最后通过免疫酶标技术显示样本内OsHV-1的组织分布。为了达到最佳检测效果,对间接ISPCR的扩增循环数以及组织消化的蛋白酶K浓度进行优化。结果显示,最适PCR扩增循环数为20,蛋白酶K浓度为20μg/mL。利用经优化的间接ISPCR检测方法,对OsHV-1在魁蚶外套膜、鳃、肝胰腺、斧足和闭壳肌5个样本中的组织分布情况和亲嗜性进行检测和分析。病毒阳性信号主要分布于魁蚶外套膜结缔组织中浸润的血细胞和成纤维细胞、肝胰腺和鳃浸润的血细胞、斧足和闭壳肌中坏死肌肉细胞的细胞核中。本研究建立的间接ISPCR检测方法具有灵敏、特异和精确定位的优点,通过组织切片上显示的病毒核酸阳性信号,能判别OsHV-1在不同组织部位的分布特点和受感染的细胞类型;适用于OsHV-1感染的确诊、病毒对不同组织器官的亲嗜性、病毒侵染途径和致病机理等相关研究。
[期刊] 水产学报
[作者]
赵小金 张盛静 白昌明 岳志芹 王崇明 尹伟力 蔡生力 黄倢
为建立牡蛎疱疹病毒魁蚶株快速、灵敏、准确和操作简便的检测方法,实验根据已测序完成的Os HV-1-SB全基因组序列,选择其保守区域,建立了交叉引物等温扩增检测方法,并对反应温度、d NTPs、Mg2+浓度和反应时间进行了优化。结果显示,最佳温度为63℃,反应时间为60 min,d NTPs浓度为1.4 mmol/L,Mg2+浓度为6 mmol/L。该方法检测灵敏度为30拷贝的质粒DNA,并且特异性较强,与贝类常见病原急性病毒性坏死病毒、鲍鱼疱疹病毒、派琴虫、包纳米虫、马尔泰虫以及对虾白斑综合征病毒和副溶血弧菌均无交叉反应。使用实验建立的CPA检测方法对2012年分别采自韩国庆尚南道、山东长岛、...
[期刊] 水产学报
[作者]
周勇 曾令兵 张辉 范玉顶 徐进
针对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA解旋酶基因编码区序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增出长度为1 446 bp的基因编码区片段,克隆到pMD19T载体上,构建重组质粒。经PCR鉴定与测序分析确认正确后,以10倍梯度稀释重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.999 1,斜率为-3.412;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×107copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出鲤疱疹...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
赵欣 贾鹏 刘莹 王津津 史秀杰 潘广 郑晓聪 于力 何俊强 刘荭 吴志新
本研究建立了定量检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,并与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法的灵敏性、重复性、特异性和临床样品检测做了比较分析。结果表明,与qPCR相比,ddPCR具有相同的特异性,其灵敏性比qPCR低20倍。在定量CyHV-2 DNA时,ddPCR(R2=0.994)和qPCR(R2=0.994)均表现出良好
[期刊] 水产学报
[作者]
李聪慧 徐进 刘文枝 周勇 曾令兵
为建立一种操作简单、结果准确可靠、结果判定直观、成本低廉的现场快速检测方法,为锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus,KHV)疾病的防控提供技术支撑,根据KHV保守的DNA聚合酶(DNA polymerase,Sph)基因,设计一组单交叉扩增引物,以构建的Sph基因重组质粒作为标准DNA模板,采用单交叉引物等温扩增技术(single cross priming amplification,SCPA)进行扩增,优化反应体系的引物浓度组合、Mg2+浓度、d NTPs浓度、反应温度和时间,并结合核酸试纸条技术(nucleic acid test strip detection method)...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
杜玉东 陈孝煊 吴志新 王敏 刘迁 夏君 王树云 李莉娟
针对斑点叉尾鮰疱疹病毒(CCV)的ORF6基因设计引物和探针,PCR产物在扩增过程中标记地高辛,探针5′端用生物素标记,建立了CCV的敏感、快速、环保的PCR-ELISA检测方法。对反应条件进行了优化,并评估了该方法的特异性和敏感性。结果表明:该方法可特异性检测CCV DNA,与各对照均无交叉反应,具有高度特异性;该方法对CCV DNA的检测阈值为5 fg,敏感性是常规PCR检测方法的10倍。用此方法对人工感染样品进行检测,能够检测到感染组织中的CCV DNA。该方法能够定性和半定量检测CCV DNA,可用于斑点叉尾鮰疱疹病毒的检测、斑点叉尾鮰暴发性流行病的诊断。
[期刊] 水产学报
[作者]
高文辉 白昌明 蔡生力 王崇明
为了建立适用于Ｏｓ ＨＶ－１不同变异株的检测方法，在牡蛎疱疹病毒（Ｏｓ ＨＶ－１）３个变异株全基因组序列比对的基础上，筛选到牡蛎疱疹病毒基因组中高度保守的ＤＮＡ聚合酶（ＤＮＡ ｐＯｌｙｍｅｒＡｓｅ）基因，据此设计巢式ｐＣｒ引物，优化ｐＣｒ反应体系和条件，建立了基于Ｏｓ ＨＶ－１ ＤＮＡ聚合酶基因的巢氏ｐＣｒ检测方法（ｐ－Ｎ ｐＣｒ检测方法），利用ｐ－Ｎ ｐＣｒ与ＣＮ ｐＣｒ检测方法对不同年份和宿主来源的Ｏｓ ＨＶ－１疑似感染样本进行检测。结果显示，ｐＮ ｐＣｒ检测方法能稳定地检出１００拷贝／μｌ的病毒ＤＮＡ；ｐ－Ｎ ｐＣｒ较Ｃ－Ｎ ｐＣｒ检测方法具有更强的特异性和更高的检出率。研究表明，本研究．．．
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
陈俊杰 李媛媛 阳瑞雪 古晶晶 汪开毓 耿毅 欧阳萍
为建立一种特异和敏感的检测锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus,KHV)潜伏感染的方法,以KHV Sph基因为靶序列设计特异性引物,通过条件优化建立Real–Time PCR检测方法,并且对该方法进行特异性和敏感性评估及临床样品应用研究。结果显示:建立的方法与鲤痘疱疹病毒、金鱼造血器官坏死病病毒和鳗鲡疱疹病毒均无交叉反应,特异性强;最低检出率为42拷贝/μL,灵敏度高。用本方法对63份临床样品进行检测,有锦鲤疱疹病毒病(KHVD)病史的18份样品的检测结果全为阳性,阳性率为100%;从有临床症状的
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王永江 周彦 李中安 苏华楠 黄爱军 唐科志 周常勇
【目的】建立一种反转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermalamplification,RT-LAMP)检测柑橘衰退病毒(Ctrus tristeza virus,CTV)的一步法检测技术。【方法】根据CTV保守的p25设计2对特异性引物,对RT-LAMP体系的最佳反应条件、特异性、灵敏度等进行研究。【结果】建立了一种特异性检测CTV的RT-LAMP方法,该方法的灵敏度比RT-PCR方法高100倍,产物通过Acc I酶切得到验证,而且反应产物中加入SYBR Green I可直接观察样品是否感染CTV。【结论】RT-LAMP法...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张永江 辛言言 李桂芬 乾义柯
【目的】葡萄Ａ病毒（ＧｒＡｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ａ，ＧｖＡ）是葡萄皱木复合病的重要病原之一，以带毒种苗的嫁接为田间主要传播途径。使用无毒葡萄苗木进行生产是控制该病毒病害的根本措施，而简便灵敏的检测技术是筛选无毒种苗的有效保证。为此，开展针对ＧｖＡ的反转录环介导等温扩增技术（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒＡｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉＡｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍＡｌ ＡｍｐｌｉｆｉｃＡｔｉｏｎ，ｒｔ－ｌＡｍｐ）研究，旨在建立其ｒｔ－ｌＡｍｐ特异性检测方法。【方法】通过比对分析ＧｖＡ的ｃｐ（ｃｏＡｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）基因序列并经引物设计软件ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｐｌｏｒｅ ４．０设计，获得６条检测．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘业兵 张磊 宁宜宝 王琴 范学政
【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪细小病毒(PPV)环介导等温扩增(LAMP)方法,为诊断猪细小病毒提供准确可靠工具。【方法】根据GenBank公布的PPV序列,在其保守序列区域设计了多套LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测反应进程并筛选最佳引物、反应条件,建立了对PPV病毒DNA进行特异扩增的LAMP检测方法,并可通过加入SYBR Green I肉眼判断结果。【结果】该方法在63℃恒温下作用45min,PPV病毒DNA获得了高效率的特异性扩增;其检出限量为0.23TCID50,敏感性高;在反应结束后加入SYBR Green I肉眼...
关键词：
猪细小病毒 LAMP 检测方法
[期刊] 中国农业科学
[作者]
陈柳 尚巧霞 陈笑瑜 邢冬梅 冉策 魏艳敏 赵晓燕 刘正坪
【目的】草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)是侵染草莓的重要病毒,严重影响草莓果实的产量和品质。研究旨在建立利用反转录等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测SMYEV的方法。【方法】根据SMYEV外壳蛋白基因3′端保守序列设计4个特异性引物SMYEV-FIP(5′-CAGATCAGCGACAATTTGGACTCCTGAGGAACTTGCTGCT-3′)、SMYEV-BIP(5′-GCTTTGTC GGGGATCCTG...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
周勇 范玉顶 徐进 马杰 江南 刘文枝 曾令兵
根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)ORF 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-ORF 4。将p ET-32a-ORF 4重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到融合表达的重组蛋白,融合表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,其分子质量约为57 ku,与预期大小一致
[期刊] 中国水产科学
[作者]
孔善云 姜有声 许丹 谢骏 吕利群
Ⅱ型鲤疱疹病毒（ｃｙｐｒｉｎｉｄ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ２，ｃｙ ｈｖ－２）是引起养殖异育银鲫（ｃａｒａｓｓｉｕｓ ａｕｒａｔｕｓ ｇｉｂｅｌｉｏ）造血器官坏死症的致病病原。在临床筛查中基于病毒核酸的ｐｃｒ和ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｐｃｒ技术已经建立，但是稳定性更强的免疫学诊断技术国内外尚无报道。本研究目的是利用ｃｙ ｈｖ－２编码的ｏｒＦ７２基因（ｇｅｎ ｂａｎｋ登录号：ａＦＪ２０５０２．１）所编码的衣壳蛋白作为捕获抗原，通过识别感染病毒的鱼体中的相应抗体，从而对样本进行临床免疫学检测。首先采用ｐｃｒ方法从纯化的ｃｙ ｈｖ－２基因组中扩增ｏｒＦ７２基因，并把该基因克隆至原核表达载体ｐｇｅＸ－４ｔ．．．
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