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[期刊] 水产学报
[作者]
闵洁 汪开毓 刘韬 贺扬 胡伟 罗梦笛
鲁氏耶尔森菌是一种具有广泛致病性的条件致病肠杆菌。三型分泌系统(T3SS)是该菌的重要毒力系统,其中invF基因是T3SS功能表达的重要调控因子。为探讨invF和T3SS对Y.ruckeri致病作用的影响,本研究构建了Y.ruckeri SC09株invF基因的无痕缺失株,并对其生物学特性进行研究。通过融合PCR方法,将invF基因的上、下游片段A、C融合,构建同源臂AC;将获得的同源臂AC连接入自杀质粒pLP12,构建pLP12-invF同源重组载体;pLP12-invF电转化进入供体菌株大肠杆菌β21
[期刊] 中国水产科学
[作者]
师红亚 董浚键 张德锋 孙成飞 田园园 曾庆凯 卢迈新 叶星
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵良友 高雪丽 刘超男 申海龙 姜南 万伟泉 吕晓萍 郑世民
为了探究副猪嗜血杆菌外膜脂蛋白编码基因vacJ在其致病中的作用,以血清5型临诊分离株HS49为研究对象,构建了vacJ基因缺失菌株(ΔvacJ),进而比较了野生株与缺失株在生长特性、对细胞的黏附及入侵和毒力等方面的差异。结果显示,与野生株相比较,缺失vacJ后的菌株生长速率明显下降,对PK-15细胞的黏附和入侵能力则明显降低,形成生物被膜的能力也显著下降。缺失vacJ菌株对Balb/C小鼠感染模型的LD_(50)是野生株的14倍,表明vacJ基因敲除后,副猪嗜血杆菌毒力明显下降。表明vacJ基因与副猪嗜血
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
陈怀青 陆承平
将含有转座子Tn5的自杀性质粒pZJ25,用滤膜接合法从大肠杆菌S 17株中转移到有S层的嗜水气单胞菌J-1株。通过卡那霉素抗性筛选出嗜水气单胞菌Tn 5转移接合体。用嗜水气单胞菌TF 7株S蛋白抗体作点印迹免疫酶分析,从转移接合体中检测到一株S蛋白阴性的菌株,命名为TM 6。经检测TM 6的生理生化特性与J-1株基本相同,也能产生HEC毒素和蛋白酶,但超薄切片中未见S层结构。用菌体的酸性甘氨酸抽提物作SDS-PAGE,缺少S蛋白相应条带。用J-1株S蛋白抗血清作免疫转印,亦为阴性结果。表明TM 6是一株S层缺失突变的嗜水气单胞菌。
关键词：
嗜水气单胞菌 S层 Tn5诱变
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
陈晓萌 王悦辰 柴栩婴 李爱宁 王永林
【目的】欧美杨细菌性溃疡病是革兰氏阴性细菌Lonsdalea populi引起的杨树枝干病害,其危害严重,已造成欧美杨人工林的重要经济损失。双组分系统是细菌致病过程的关键调控途径之一。目前,欧美杨细菌性溃疡病菌的双组分系统如何调控致病过程仍缺乏系统研究。因此,本研究开展欧美杨细菌性溃疡病菌的双组分编码基因的缺失突变及突变体表型分析,为深入解析其致病机制提供遗传材料。【方法】本研究以欧美杨溃疡病菌菌株N-5-1为研究对象,利用双亲结合方法获得了28个双组分系统基因的缺失突变体,并通过表型测定方法分析了这些基因突变体的致病性、生长、游动性、生物膜形成和抗逆性等表型特征,研究不同双组分系统编码基因对该病菌致病过程的调控。【结果】构建了36个欧美杨溃疡病菌的双组分编码基因的敲除重组载体,获得了28个基因的缺失突变体。致病性测定表明18个双组分基因的敲除降低了病原菌的毒性,其中8个突变体毒性丧失。此外,还获得了调控游动性和生物膜形成能力的突变体以及在逆境胁迫反应(金属离子、盐离子、抗生素等胁迫)有缺陷的突变体。【结论】本研究获得了5个显著影响欧美杨细菌性溃疡病菌毒性及其他生物表型的双组分基因,为后续双组分信号调控致病机制研究提供了遗传材料。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李淼 李春玲 宋帅 杨冬霞 蔡汝健 李艳 蒋智勇 勾红潮 楚品品
分泌型核酸酶基因ssnA是近年来研究发现的一种脱氧核糖核酸酶,被认为是一种猪链球菌2型(SS2)潜在的毒力因子。为了分析ssnA基因对于SS2毒力的影响,通过体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,电转化进入SS2,经同源重组构建了SS2流行毒力株GD01的ssnA基因缺失突变菌株,并通过比较分析了野生菌株与缺失突变菌株的生长特性及溶血活性等生物学特性。结果显示,GD01株与ΔssnA突变株的生长速度及溶血活性没有明显差异;ssnA基因缺失后SS2对Hep-2细胞的黏附及入侵能力则明显下降。小鼠毒力试验结果显
[期刊] 华北农学报
[作者]
李娜 宁程程 郭蕴 季春辉 王立霞 张亚萍 孟庆玲 乔军 才学鹏
为探究鼠伤寒沙门菌sRNA STnc1220的分子特征、生物学功能及对细菌毒力的影响，通过PCR扩增了鼠伤寒沙门菌sRNA STnc1220基因，分析了其分子特征，利用TargetRNA2网站预测STnc1220基因可能调控的靶基因；利用λ-Red同源重组技术构建沙门菌(STM)-基因缺失突变株，并与亲本SL1344比较，对其生长特性、生化特性、遗传稳定性、生物被膜(BF)形成能力、在不同应激环境中(pH值、H_2O_2、高盐和乙醇胁迫环境)的适应性、通过黏附侵染巨噬细胞和小鼠感染试验对致病力进行研究。结果显示，STnc1220基因全长73 bp、其上游5′-UTR存在-10和-35启动子结合位点，预测其潜在的靶基因为barA基因；试验成功构建缺失株STM-ΔSTnc1220,且具有良好的遗传稳定性；与SL1344亲本株相比，缺失株的生长速度、生化特性及生物被膜形成能力没有发生改变；在pH=4.8,pH=9和H_2O_2条件下生长速率差异不显著，但在4%NaCl环境下，缺失株在7 h后生长速率明显高于亲本株，在3.8%乙醇环境中缺失株在对数期的生长速率显著升高(P<0.05);其对巨噬细胞中黏附和侵袭能力极显著降低(P<0.01),小鼠LD_(50)显著升高，对小鼠的肝脏和脾脏的病理损伤致病力减弱。表明STnc1220基因在环境适应性和毒力调控中发挥了重要的作用。为阐明鼠伤寒沙门菌的致病机制提供理论依据。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
白雪瑞 王权 陈永军 万莹 凌娇 王亚磊 蒋蔚
[目的]外膜蛋白Omp A是一个多功能蛋白,在很多革兰氏阴性菌的环境适应性和致病性过程中发挥重要作用,而副溶血弧菌Omp A的功能尚未见报道。本试验旨在研究omp A基因(VPA1186)对副溶血弧菌生物学特性及致病性的影响。[方法]通过构建副溶血弧菌SH112株的omp A基因缺失株和互补株,开展对该基因在细菌生长特性、生物被膜形成、运动性、血清杀菌、细胞黏附、细胞毒性,组织载量以及小鼠致病性等相关生物学特性和致病性的影响研究。[结果]omp A的缺失不影响副溶血弧菌的生长速度、生物被膜形成能力和运动性。野生株和Δomp A的黏附和抗血清试验结果无显著差异。但Δomp A对Caco-2细胞的毒性作用显著低于野生株。小鼠染毒验结果显示,与感染野生株的小鼠相比,感染Δomp A的小鼠症状明显减轻,存活率更高,Δomp A在小鼠血液和肝脏中的带菌量显著低于野生株,而互补株的毒力恢复至野生株水平,表明omp A缺失能显著降低副溶血弧菌的毒力。[结论]omp A与副溶血弧菌的致病性相关,为潜在的毒力因子。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
丁家波 程君生 牟巍 毛开荣 张尔利 蒋玉文
【目的】WboA基因编码光滑型布鲁氏菌脂多糖(LPS)O-侧链合成必须的糖基转移酶,该基因的缺失或破坏会影响布鲁氏菌光滑型表型的形成。本研究拟构建WboA基因缺失的重组粗糙型布鲁氏菌,以使布鲁氏菌弱毒疫苗与野毒株布鲁氏菌感染相区分。【方法】以猪源光滑型布鲁氏菌S2株为研究对象,通过同源重组将氯霉素抗性基因(Cmr)完全替代S2株的WboA基因,获得重组粗糙型布鲁氏菌rS2-WboA株。【结果】rS2-WboA株在适宜的培养基(TSA)上传50代后仍保持对氯霉素的抗性。用1×107 CFU rS2-WboA免疫Balb/c小鼠和豚鼠,1个月后均能通过平板凝集试验检测到粗糙型抗体。1×1011 C...
关键词：
布鲁氏菌 WboA基因 免疫性
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张晶晶 孙慧敏 宋家升 鲍恩东
[目的]为了开发一种能够预防感染、阻止潜伏期建立的猫疱疹病毒I型（FHV-1）弱毒疫苗，本研究利用同源重组以及CRISPR/Cas9技术将FHV-1的gIgE基因替换为红色荧光蛋白RFP。[方法]试验构建了针对gIgE基因的3 条sgRNA及表达Cas9蛋白的质粒，将含有sgRNA及Cas9蛋白的质粒与含有RFP的转移载体共转染到猫肾细胞（F81），通过噬斑纯化以及有限稀释方法进行病毒纯化，以重组毒感染F81细胞连续10 代验证其遗传稳定性，通过测定重组毒以及亲本毒H07的病毒滴度、一步生长曲线以及判断噬斑大小评价其生物学特性。[结果]试验结果显示，FHV-1 gIgE基因缺失毒株得到成功构建并将其命名为FHV-ΔgIgE-RFP；提取重组毒DNA通过PCR验证gIgE基因无目的条带，表明重组毒纯化成功，再通过PCR验证RFP基因有目的条带，表明重组毒成功插入外源基因；病毒滴度测定结果显示，与亲本毒相比重组毒的病毒滴度下降了10倍；在F1～F10连续传代过程中可观察到RFP荧光表达且无减弱现象，表明重组毒可稳定表达外源基因；测定FHV-ΔgIgE-RFP以及H07的生长曲线，重组毒的生长趋势与亲本毒大致相同，表明插入外源基因并不会改变病毒本身的生长特性；噬斑观察及染色结果显示，无论是在病毒感染细胞前期还是后期，重组毒的噬斑都要小于亲本毒，表明缺失gIgE基因后病毒毒力下降。[结论]上述结果说明，本研究成功构建并筛选出了FHV-1 gIgE基因缺失致弱毒株，为开发疱疹病毒弱毒活载体疫苗奠定了坚实平台与基础。
关键词：
FHV-1 致弱毒株 重组病毒 病毒筛选
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
刘定远 王春元 于永翔 王印庚 李京泽 张晓松 秦蕾 张正
美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp. damselae， PDD)是广泛分布于全球海洋环境中的一种致病菌。本研究以实验室保存的一株高致病性PDD菌株(PDD1608)作为对象，初步探究毒力基因dly对PDD菌株的生物学特性和致病力的影响。利用λRed重组技术成功构建毒力基因dly缺失株Δdly PDD1608::Cm，比较野生株和缺失株的生长、涌动性、药物敏感性、生理生化特性、生物被膜形成能力、菌株及胞外产物(extracellular products， ECP)的溶血性和磷脂酶活性等生物学特性。选用海水青鳉鱼(Oryzias melastigma)作为实验动物，通过人工感染实验测定野生株和缺失株及其ECP对海水青鳉鱼的致病性。毒力基因dly缺失后导致PDD菌株的生长变慢，涌动性、溶血性和磷脂酶活性均降低；野生株和缺失株的药物敏感性和生理生化特性未产生变化；与野生株相比，缺失株的生物被膜形成能力有显著性差异(P<0.05)；人工感染实验表明，缺失株及其ECP对海水青鳉鱼的致病性降低。毒力基因dly影响PDD菌株的生长、涌动性、溶血性和磷脂酶活性等多种生物学特性，并且与PDD菌株及其ECP的致病力强弱密切相关。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李春华 李祥瑞 魏晓锋 徐立新 李震 陈芳
根据GenBank中的牛IL 2基因序列 ,设计一对引物Pa和Pd ,以牛外周血淋巴细胞为材料 ,用RT PCR方法扩增得到牛IL 2cDNA ,测序发现在扩增产物的第 2 4 0位缺失了一个A碱基。采用重叠延伸剪接术 (SOE法 )向突变体定点插入该碱基 ,然后与表达载体连接 ,获得了正确的表达产物。经RT PCR检测证明 ,重组的牛IL 2蛋白具有较好的生物学活性 ,能诱导肿瘤坏死因子TNF α和干扰素IFN γ的产生。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王利莹 董宣 王国浩 王德浩 谢景媚 罗婧斐 王显伟 黄倢
急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease， AHPND)严重影响了我国乃至全球对虾养殖业的发展。近期研究发现，致病菌毒力质粒携带trb型Ⅳ型分泌系统(Type Ⅳ secretion system， T4SS)，可在高菌体密度下介导毒力质粒发生接合转移，从而导致AHPND致病菌多样性。为探究群体感应与T4SS表达以及毒力质粒接合转移的关系，本研究以副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)群体感应系统的高密度调控子OpaR为研究对象，在致AHPND副溶血弧菌20130629002S01::cat(Vp2S01::cat)菌株基础上，利用同源重组技术构建opaR基因缺失株Vp2S01::catΔopaR。比较了出发菌株和缺失株在生长性能、运动性和生物被膜形成能力等方面的差异，分析了opaR基因对T4SS基因表达量以及质粒接合转移效率的影响。结果显示，opaR基因缺失不影响细菌的生长特性和群集运动，但泳动能力显著增加，生物被膜形成能力显著下降；接合转移实验显示，opaR基因缺失显著提高T4SS表达水平和接合转移效率。本研究为解析群体感应系统调控AHPND致病菌T4SS表达以及毒力质粒接合转移机制提供了基础数据，可为控制AHPND致病菌毒力质粒传播提供技术支撑。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
车建美 蓝江林 刘波
【目的】采用电击法对青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)进行gfp/luxAB基因双标记,研究标记前后菌株的生长差异、以及侵染性和致病性的变化。【方法】通过电击法进行青枯雷尔氏菌的遗传转化,采用番茄组培苗对标记菌株的侵染条件和侵染过程进行初步研究。【结果】成功地采用gfp/luxAB基因标记了青枯雷尔氏菌。标记后的菌体细胞形状与亲本菌株形状相同,均为长椭圆形,近杆状,整个细胞呈现绿色荧光,PCR结果表明,从标记青枯雷尔氏菌菌株的基因组DNA中扩增出约3.0kb的gfp基因片段。标记菌在对数生长期,荧光素酶活性快速增加,到稳定期,荧光素酶活性降低。在无选择压力条件下连续移...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
王真 欧齐星 王双山 吕艳丽 吴清民
为筛选具有诊断标记的布鲁氏菌病疫苗菌株,本研究利用同源重组和负筛选技术,构建了流产布鲁氏菌株2 308的ATP/GTP结合蛋白基因缺失株BDA14,并通过菌落染色和凝集特性,培养传代,小鼠接种试验及怀孕羊攻毒试验对其生物学特性、安全性和免疫效果进行了研究。结果表明:1)缺失菌株BDA14为粗糙型菌株,体外培养传代表型不发生改变;2)缺失菌株BDA14在小鼠体内的毒力与亲本菌株2308相比显著降低,且不产生针对OPS(O-antigen)的抗体;3)缺失菌株BDA14可提供与疫苗株RB51相当的攻毒保护力;4)缺失菌株BDA14对怀孕靶动物的安全性显著提高,接种怀孕羊不引起流产。说明ATP/GT...
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