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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
杜娟 兰文升 刘荭 郑晓聪 陈孝煊
通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得编码病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV)核蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET28a,并在E.coli BL21(DE3)中得到表达,用SDS-PAGE与Western-blot对表达产物进行鉴定。结果表明,通过RT-PCR扩增获得长度为1 221bp核蛋白基因片段,诱导表达重组质粒pET28a-N,经SDS-PAGE检测,IPTG终浓度为1mmol/L时,诱导5h蛋白表达量最高,获得的目的蛋白大小与N蛋白的预测分子质量一致,约为48ku。诱导后的菌液进行超声波破碎后,将沉淀和上清...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
朱若林 沈娇娇 蒋书东 杨彩桥 张晓华 鲍传和 彭开松
为了对鱼类病毒性出血性败血症病毒(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)基质蛋白(matrix protein, M)进行功能研究,本实验通过PCR扩增了M基因全长序列,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用间接ELISA检测抗体效价,并运用Westernblot和间接免疫荧光检测抗体特异性。结果显示,M基因全长为606bp,IPTG诱导得到的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,大小约为36 kD,比预计略小。间接ELISA检测抗体效价大于1:102400,Westernblot检测显示该抗体可以特异性识别纯化的融合蛋白和VHSV感染的鲤上皮瘤(epithelioma papulosum cyprini, EPC)细胞中的M蛋白。间接免疫荧光结果显示M蛋白多抗能识别感染VHSV的EPC细胞中的M蛋白,且M蛋白主要定位于细胞质和细胞膜。本研究中M蛋白多克隆抗体的制备将有助于开展M蛋白的功能研究及疾病的免疫学诊断。
[期刊] 水产学报
[作者]
王宏华 侯竹美 张全启 于海洋 王志刚 齐洁 王旭波
为制备病毒性出血性败血症病毒（ＶＨＳＶ）单链抗体（Ｓｉｎｇｌｅ ｃＨａｉｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＳｃｆＶ）并鉴定其生物学功能，本研究提取抗ＶＨＳＶ单抗１ｇ５的杂交瘤细胞株总ｒｎａ并反转录获得ｃｄｎａ模板，通过Ｐｃｒ扩增ＶＨＳＶ抗体的轻链可变区（Ｖｌ）和重链可变区（ＶＨ）编码序列，将其拼接成单链抗体Ｓｃ ｆＶ基因后插入载体Ｐｅｔ２８ａ中，构建原核表达重组质粒并在大肠杆菌中诱导表达。结果表明，单链抗体主要以可溶性形式表达，分子量约２８ ｋｕ，能特异性识别ＶＨＳＶ病毒的ｇ蛋白并对ＶＨＳＶ病毒具有体外中和活性，其对ＶＨＳＶ病毒的ｇ蛋白亲和力（ｋｄ）达到１．４×１０～（．．．
关键词：
鱼 病毒性出血性败血症病毒 单链抗体
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李传山 任力刚 李维英 杨增岐 郭蔼光
为了在原核系统中高效表达兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60,应用RT-PCR方法从兔出血症病毒(RHDV)西北分离株YL中克隆出了衣壳蛋白VP60基因并测序,结果显示,YL株VP60基因全长1740 bp,GC含量为55.3%,已在GenBank中注册(登录号为DQ530363),VP60基因与中国RHDV最早期分离株WX84的VP60基因核苷酸序列同源性为93.0%,氨基酸序列同源性为95.8%。构建成功YL株VP60基因原核表达载体VP60-pET32a,转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。1 mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测结果显示,VP60融合蛋白分子...
[期刊] 水产学报
[作者]
罗卫 田飞焱 刘荭 陈焕春 李惠芳 刘宗晓 王侃 蔡伊娜 吕建强
利用RT-PCR技术获得病毒性神经坏死病毒0603株的衣壳蛋白基因,将其插入到杆状病毒Bac-To-Bac表达系统的pFastBacⅠ质粒中,构建了pFastBac-cp质粒。转化DH10Bac大肠杆菌后获得重组穿梭载体Bacmid-cp,脂质体介导将其转染Sf9细胞产生有感染性的重组杆状病毒AcNPV-cp。利用AcNPV-cp感染Sf9细胞后,SDS-PAGE分析可见大小约为37ku的特异性蛋白带,Western-blotting分析发现,其可以与病毒性神经坏死病毒阳性血清反应出现特异性的杂交带。试验结果表明,AcNPV-cp在Sf9细胞中成功地表达了病毒性神经坏死病毒的衣壳蛋白,其具有良...
关键词：
病毒性神经坏死病毒 衣壳蛋白 病毒样颗粒
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王玢瑸 哲名家 刘光清 张淼涛
【目的】构建重组兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)VPg(Viral Protein Ge-nome-Linked,VPg)蛋白基因的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达和纯化VPg蛋白,制备多克隆抗体,并检测抗体的基本特性。【方法】用PCR方法扩增RHDVVPg基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导,使之重组表达VPg蛋白,并用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。PCR扩增获得了345bp的VPg基因,用纯化的重组VPg蛋白免疫试验兔,制备抗VPg的多克隆抗体,用Wes...
关键词：
VPg 原核表达 多克隆抗体
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李月红 付云红 Julia Pridgeon 宋琳 张东鸣
【目的】克隆鲤鱼春季病毒血症病毒(SVCV)的磷蛋白(P蛋白)基因,并对其进行原核表达,为进一步制备SVCV P蛋白单克隆抗体及建立新的SVCV诊断方法奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增SVCV P蛋白基因,将其克隆入pET-28a(+)载体中,获得原核重组表达质粒pET28-P,进行原核表达。将该重组原核表达质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中,用0.4mmol/L IPTG进行诱导表达,用镍亲和层析试剂盒对表达产物进行纯化,分别用SDS-PAGE和Western Blotting方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了SVCV P蛋白基因,该基因长度为933bp。成功构建...
关键词：
鲤春病毒血症病毒 P蛋白 原核表达
[期刊] 水产学报
[作者]
刘林 徐诗英 李婧慧 邹勇 倪金俤 杨鸢劼 曹广力 薛仁宇 陈辉 贡成良
为了探讨草鱼出血病病毒(GCRV)VP6亚单位疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用,将vp6基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),构建了重组质粒pET28a(+)-VP6。SDS-PAGE和Western-blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为43 ku,主要以包涵体形式存在,重组蛋白占菌体总蛋白的20%左右;Ni2+柱纯化后的重组蛋白,以每尾500μg肌肉注射免疫草鱼(14～20 cm,60～120 g),并在第14、21、28、49、70天通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,免疫注射后第14天可检测到鱼体产生的特异性抗体,第21天达到最高峰,第70天仍可检测到抗体的存在;免疫...
关键词：
草鱼出血病病毒 原核表达 纯化 免疫
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张大鹏 吕宁 符容婕 郭蔼光
【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60ku,制备的...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
马鹏 李林杰 常秋燕 王悦萦 马晓霞 马忠仁
【目的】本研究旨在对来源于白牦牛的牛病毒性腹泻病毒(BVDV) GSTZ株的E0基因进行分析,并利用E0基因对GSTZ进行基因分型。【方法】通过提取牛病毒性腹泻病毒(BVDV) RNA,使用RT-PCR技术扩增BVDV E0基因,将其插入到pET-28a中,构建pET-28a-E0原核表达载体,转化BL21(DE3)感受态细胞,筛选阳性克隆,鉴定及测序。IPTG诱导后使用BVDV阳性血清作一抗,经western blot鉴定。根据E0基因的序列进行同源性分析以及构建E0基因系统发育进化树。利用DNAstar预测E0蛋白的抗原表位。【结果】本研究表达的E0蛋白大小与预期结果相符且该蛋白具有良好的抗原性。通过对E0基因序列的同源性分析以及构建E0基因系统发育进化树,说明牛病毒性腹泻病毒GSTZ株基因型可能属于牛病毒性腹泻病毒-1a亚型,也可能是其他基因亚型发生较大突变产生变异。通过预测E0蛋白B细胞的抗原表位主要位于:7-12、22-26、62-63、94-97、101-105、115-119、127-128、138-140、185-187、215-219位氨基酸残基; T细胞潜在优势抗原区域主要位于:10-14、19-31、36-43、52-58、77-86、96-98、137-140、148-150、167-191、209-211位氨基酸残基。【结论】E0蛋白具有良好的抗原性,通过对抗原表位预测以及对GSTZ进行基因分型,为后续基因工程疫苗和BVDV检测试剂盒的开发提供了理论依据。
[期刊] 水产学报
[作者]
张海强 邵玲
鲤春病毒血症病毒(SVCV)能够引起鲤科鱼类大量死亡,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的重要疫病,也是我国唯一被列为一类疫病的鱼类传染病。为建立SVCV的快速免疫学诊断方法,研究其主要结构蛋白间的免疫原性差异,实验首先采用原核表达系统克隆并诱导表达,纯化SVCV的核蛋白(N)、磷蛋白(P)和基质蛋白(M),并进一步免疫新西兰白兔制备抗血清,抗血清经Protein A柱进一步纯化获得3种蛋白的多克隆抗体。利用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫印迹实验(Western blot)对抗体效价和特异
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
杨振慧 葛均青 刘荭 杨金先 郑晓聪 林天龙
根据鲤春病毒血症病毒(SVCV)基因组序列(GenBank:NC_002803),人工合成M基因开放阅读框序列,克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化工程菌株BL21(DE3),在0.1 mmol.L-1 IPTG、37℃下诱导5 h,获得高效表达的M蛋白,但其主要以包涵体的形式存在,经超声破碎、包涵体纯化后,再经Ni亲和层析柱纯化,获得高纯度的M蛋白.以纯化的M蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备了M蛋白的多克隆抗血清.ELISA检测显示抗血清的效价达1∶128000;western blot分析显示抗血清能够识别SVCV的M蛋白,表明其具有较好的灵敏性和特异性.
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
刘梦茜 李春燕 陈仕怡 袁晓琴 星东 王全溪
本试验设计了M基因的特异性引物,扩增了M基因,成功构建了重组质粒,并转化至Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中,优化了异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达条件.结果表明,重组表达的融合蛋白Pet-32a-M大小约为43 ku,与预期大小相符.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表明,M蛋白为包涵体蛋白,且在IPTG浓度为0.8 mmol·L-1,温度为37℃,诱导时间为8 h的条件下,蛋白表达效果最佳.蛋白免疫印迹检测结果进一步显示,重组蛋白Pe
关键词：
猪流行性腹泻病毒 M蛋白 原核表达
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
乔艳艳 杨翠云 于翠 曹洁 马青 张丽莉
根据烟草环斑病毒外壳蛋白(TRSV-CP)基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR方法,获得烟草环斑病毒基因组中编码外壳蛋白部分基因片段,将其插入原核表达载体pET28a中,获得重组表达质粒pET-CP,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导蛋白大量表达。重组蛋白经过Ni+-NTA纯化后,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,TRSV-CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,产生的融合蛋白分子质量约为34 ku,并具有免疫学活性。以纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,多抗血清效价达1∶409 600,可以与重组蛋白发生抗原抗体反应。
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