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[期刊] 中国农业科学
[作者]
周伦江 王隆柏 方勤美 吴学敏 车勇良 陈如敬 魏宏 庄向生
【目的】研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染MARC-145细胞生长相关蛋白表达量的变化,明确差异蛋白的功能信息,为深入研究PRRSV病毒复制和致病机理奠定基础。【方法】采用差异蛋白质组学和Western blotting技术,通过建立双向凝胶电泳,对高致病性PRRSV感染MARC-145细胞后表达量差异蛋白质进行了胶内酶解、质谱分析鉴定及数据库检索,明确差异蛋白质的相关信息。【结果】得到7个表达稳定、重复性好的蛋白点,其中有5个蛋白点找到匹配蛋白,分别为热休克蛋白70、硫氧还蛋白、S100钙结合蛋白A6、3-磷酸甘油脱氢酶和内参肌动蛋白,其余2个蛋白点为未知蛋白。在MARC-...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
方剑玉 郑其升 郭小参 侯凤香 王琳 陶红梅 侯继波 陈溥言
采用RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)临床分离株的M基因(525 bp),通过设计4对引物,把M蛋白分成4段K1(78-112)、K2(98-131)、K3(118-153)、K4(139-174),分别扩增相应基因M1、K1、K2、K3和K4,连接pET-32a(+)表达载体,经鉴定后转化Escherichia coliBL21,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blot检测结果显示,分别在相对分子质量30.8×103和24.4×103位置出现目的条带,重组蛋白均可与阳性血清发生特异反应。将蛋白M1免疫BALB/c小鼠,于第三次免2周后从小鼠脾脏...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王小敏 李燕华 蔺涛 刘闰夏 何孔旺 童光志 袁世山
旨为建立高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)野毒株持续性感染细胞模型。通过将HP-PRRSV野毒株JX143感染Marc-145细胞,感染的细胞经连续传代35代,建立了稳定的PRRSV持续感染的细胞模型,获得了JX143-Marc-145-P35细胞株。应用RT-PCR、免疫荧光、空斑形态分析等技术跟踪观察了JX143-Marc145细胞株连续传代过程中病毒在细胞内的存在和生物学特性的变化。为了进一步分析病毒持续性感染过程中基因的特征性变化,通过RT-PCR扩增出JX143-Marc145-P35的全基因,并进行测序和序列分析。结果表明,在细胞模型建立的过程中,细胞病变(Cyto...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
曹剑波 李彬 陈焕春 肖少波
对高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(HP-PRRSV)人工感染的成年猪脏器进行透射电子显微镜观察,结果发现,肺部组织细胞病变最严重,部分毛细血管破裂,毛细血管内皮细胞裂解,肺泡巨噬细胞线粒体嵴肿胀严重;脑部组织神经元细胞凋亡和胶质细胞坏死;肾脏和淋巴结组织中均出现病毒的复制和线粒体嵴的肿胀。该结果为阐明HP-PRRSV的致病机理提供了实验依据。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张建武 庄金山 袁世山
【目的】对来自2006年猪病流行爆发地的组织样品进行多种病毒的检测,确定引起本次流行的致病病原及PRRSV的分子流行病学特征。【方法】利用(RT-)PCR对采集的样品进行PRRSV北美型和欧洲型、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)以及瘟病毒的检测,对PRRSV阳性的进行ORF5的序列测定并分析。【结果】检测到16份PRRSV北美型阳性样品,PCV2阳性样品2份,其它病毒均未检到。PRRSV ORF5序列分析表明笔者分离到的PRRSV株可分为2个群。【结论】(1)PRRSV与2006年肆虐中国养猪业的猪病流行有直接关系;(2)2006年PRR...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
欧阳康 马玲 吴健敏 白安斌 邓世杰 谢彬 袁书智
收集2006～2010年来自广西12个地市的21份高致病性猪繁殖与呼吸综合征(H-PRRSV)阳性病料,克隆包含缺失区的Nsp2基因片段并登陆Genbank(登录号为HQ015350-HQ015370),经序列比较发现,该21株Nsp2序列具有与我国2006年爆发的H-PRRSV完全一致的缺失特征,广西H-PRRSV流行毒株Nsp2基因随着流行时间的推移朝着偏离猪高致病性蓝耳病代表毒株JXA1株的方向发展,在遗传进化树上呈地域性分布。此外,广西H-PRRSV毒株氨基酸逐渐发生变异,特别是2010年来源于3个不同地方的3个毒株5个位点均发生突变,即P19L、R33Q、R34F、S43I、E107...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王旭荣 张彩勤 张春红 赵炳武 祝卫国 杨增岐 王建华 宋长绪
【目的】研究从江西、湖南发生持续高热的病猪体内分离的4株NSP2基因缺失的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Jiangxi-3、Jiangxi-4、Hunan-1、Hunan-2的致病力。【方法】通过Reed-Muench法,测定4株PRRSV(第3代)的TCID50,将毒株分别接种PRRSV和猪圆环病毒2型(PCV2)抗原与抗体均为阴性的健康猪,各设同居试验猪,通过检测体温、临床症状观察、RT-PCR、ELISA、病理切片等方法检测病毒的致病性。【结果】4株病毒的TCID50为10-3....
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
周伦江 王隆柏 王伟 魏宏 车勇良 陈如敬 庄向生
从某一疑似发生无名"高热病"猪场的病料中分离到一株病毒,经病毒RT-PCR鉴定、生物学特性分析、病毒结构蛋白和非结构蛋白NSP2基因序列分析及对不同日龄猪感染试验的结果表明:分离毒株为变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),该病毒具有高致病性,病毒能在Marc-145细胞上增殖并产生病变,其结构蛋白ORF2-ORF7的编码氨基酸与经典毒株VR2332、国内其他高致病性PRRSV毒株和LV毒株的氨基酸同源性分别为87.6%-97.1%、88.3%-99.6%和59.8%-79.4%;NSP2存在3处共31个氨基酸缺失,比国内其他地区流行的高致病性PRRSV毒株多缺失1个氨基酸,与VR2332...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
刘惠莉 方莹
为探讨PRRSV非结构蛋白4(NSP4)功能,体外构建了pEGFP-N1-nsp4真核表达载体,转染Marc-145细胞,利用NSP4-GFP融合蛋白携带的绿色荧光标记,研究NSP4蛋白在Marc-145细胞中的定位,并根据蛋白疏水性设计构建含有nsp4基因N端不同长度的重组pEGFP-N1表达载体,转染细胞以进一步了解NSP4蛋白是否存在核定位信号序列及其在细胞中的分布。试验结果表明:融合蛋白主要位于细胞核,部分在胞浆内。PRRSV NSP4蛋白铰链区(hinge region,HR)145～168氨基酸是决定蛋白核内定位的功能区,该片段缺失影响NSP4蛋白进入细胞核。结论:体外转染细胞内表...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王小敏 何孔旺 张文文 周忠涛 茅爱华 俞正玉 温立斌 倪艳秀 张雪寒 郭容利 吕立新 李彬 周俊明
研究2009-2010年我国部分地区猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)混合感染的情况。采用PCR和RT-PCR方法对采集自我国安徽、江苏、山东、浙江等7省的227份组织和血清样品进行PCV2和PRRSV检测。PCV2a感染率为15.9%,PCV2b感染率为44.5%,PRRSV感染率为45.8%,其中17份样品表现为PCV2a和PRRSV的混合感染,50份样品表现为PCV2b和PRRSV的混合感染,10份样品表现为PCV2a,PCV2b和PRRSV的混合感染,分别占样品总数的7.5%,22.0%和4.4%。猪群中PCV2和PRRSV的感染比较普遍,混合感染率也较高...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
江云波 方六荣 肖少波 张辉 陈焕春
目的探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)自杀性DNA疫苗的免疫效果。方法将ORF5和ORF6基因分别插入可以同时表达两个外源基因的表达载体pSCA2的26S启动子下游,获得ORF5和ORF6双基因共表达自杀性DNA疫苗pSFV-56。结果Westernblot检测证实ORF5和ORF6基因获得正确表达,并且所表达的GP5和M蛋白可以形成异源二聚体。将pSFV-56免疫Balb/c小鼠,首免后4周可检测到特异性PRRSV中和抗体,首免后8周的中和抗体最高可达1﹕32,同时还可检测到较高的特异性细胞免疫应答。进一步将pSFV-56免疫断奶仔猪,二免后4周即可产生1:8～1:16的中和抗体,直到...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
马苏 戴建君 李玉峰 段舒怡 姜平
利用重组真核质粒pcDNA3-GP5免疫BALB/c小鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0融合,经间接ELISA筛选和3次有限稀释法克隆,得到3株能稳定分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株,分别命名为4C9、5D10、5F12,其中5D10的Ig亚类为IgM。ELISA检测杂交瘤细胞培养上清液抗体的效价为1∶64~1∶1 024,腹水的效价为1∶3200~1∶10240,IFA和IPMA的检测结果均为阳性。Western-blot检测证明,这3株McAb均针对PRRSV的GP5蛋白。中和试验表明,5D10和5F12具有病毒中和活性,中和效价分别...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王中明 李素平 夏平安 尹彦涛 李伟娟 邱璜 刘明莉 刘玉松 崔保安
根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF3基因序列,利用Primer 5.0软件设计合成了1对特异性引物,经RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为765 bp的片段,并将扩增的片段插入pTG19-T载体进行测序而获得含有ORF3的阳性克隆pTG19-T-GP3。将此基因亚克隆到原核表达载体pET-32a,经筛选获得了阳性重组质粒pET-GP3,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为45 kDa的融合蛋白GP3-His,纯化后经Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。从而为进一步研究PRRSV次要结构蛋白GP3的免疫...
关键词：
PRRSV GP3蛋白 原核表达
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
苏晓鸥 乔俊文 赵德明 杨利峰 周向梅 尹晓敏 杨建民
以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白(rN蛋白)为抗原,初步建立了检测PRRSV抗体的rN-ELISA方法。根据GenBank公布的PRRSV VR2332株编码核衣壳蛋白的ORF7基因序列设计合成了一对引物,成功扩增出ORF7基因。将其克隆到PET-30a构成原核表达载体,转化宿主菌BL21(DE3)并获得表达。通过SDS-PAGE和Western blot检测证实rN蛋白获得了高效表达,且具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA法。试验证明,该方法与IDEXX公司生产的PRRSV抗体检测ELISA试剂盒对同批临床血清样本的检测结果完...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
蔡家利 姜平 简中友 马志勇 蔡宝祥
猪繁殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）Ｍ和Ｎ蛋白基因扩增与克隆蔡家利姜平简中友马志勇蔡宝祥（南京农业大学畜禽传染病研究室，南京２１００９５）ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮＡＮＤＣＬＯＮＩＮＧＯＦＭＡＮＤＮＰＲＯＴＥＩＮＧＥＮＥＯＦＰＯＲＣＩＮＥＲＥＰＲＯ...
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