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[期刊] 中国农业科学
[作者]
杨立勇 刘灶长 周立国 罗华程 罗利军
【目的】建立一种有效分离T-DNA插入突变体侧翼基因组序列的方法。【方法】分离侧翼的目标基因组序列是利用T-DNA标签法研究植物功能基因组学的一个关键步骤,笔者发展稳定高效的Actail-PCR分离技术。该技术一侧引物来自于T-DNA载体,另一侧引物为一个复性控制引物。复性控制引物在3'端为一个14bp的随机简并引物,在5'端非目标尾部序列接上一个通用引物,中间由5个多聚脱氧次黄嘌呤核苷(poly(dI))连接。【结果】Actail-PCR技术将随机简并引物重新编辑成复性控制引物,在40℃的低严谨条件下,3'端的随机简并引物可以与T-DNA插入突变体的侧翼目标区段随机的结合,扩增得到目标片段,...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
乔枫 赵开军 耿贵工 陈志
采用PCR-walking方法对水稻抗白叶枯病突变体G48的侧翼序列进行分析。通过特异性嵌套引物扩增和序列比对分析获得了该突变体T-DNA左、右边界侧翼序列,确定T-DNA插入水稻日本晴第三染色体clone OSJNBa0076E06(AC132215.1)位点上,左、右边界插入位点分别位于该克隆的第93 750、93 824碱基处。PCR-walking方法为T-DNA的侧翼序列分析提供了一种简单、高效的方法。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
徐荣旗 汪佳妮 陈捷胤 戴小枫
【目的】为鉴定棉花黄萎病菌随机插入突变体的表型特征,构建黄萎病菌遗传转化和功能基因研究的技术平台。【方法】采用农杆菌介导的T-DNA插入和高效TAIL-PCR方法。【结果】获得了2628个棉花黄萎病菌VD991的T-DNA随机插入的突变体和15个突变体插入位点的侧翼序列。部分突变体的表型特征和插入位点侧翼序列分析表明,①突变体的菌落形态分为菌丝型、菌核型和中间型3类,菌核型约占7.3%;②在摇瓶培养条件下,突变体产孢高峰在接种后第5—6天,菌核型突变体的产孢能力普遍高于菌丝型;③棉花黄萎病菌VD991可以产生胞外蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶。筛选获得蛋白酶分泌缺失的突变体3个,淀粉酶分泌缺...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
黄磊 俞咪娜 胡建坤 于俊杰 尹小乐 聂亚锋 陈志谊 刘永锋
【目的】分析稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B-726的生物学性状,分析其T-DNA插入位点的侧翼序列,克隆因外源基因插入被破坏正常表达的基因,为明确该基因在稻曲病菌致病过程中的作用奠定基础,并为稻曲病防治新途径的制定提供理论依据。【方法】通过测定突变菌株B-726生长速率、产孢能力及致病力检测,分析其生物学性状;Southern杂交分析B-726外源基因插入的拷贝数;利用HiTail-PCR获得T-DNA插入位点的侧翼序列;运用RACE-PCR技术,克隆与插入位点毗邻的基因全长;用半定量RT-PCR分析该基因表达情况。【结果】突变菌株B-726与野生菌株P1相比致病力极显著...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
谢南南 乔勇 赵锦 刘孟军
【目的】建立一种适合枣相关基因侧翼序列延伸的SON-PCR技术。【方法】在原有SON-PCR基础上进行改进,将原有SON-PCR第2轮两段式反应改进为两步式,即第2轮首先加入单引物进行单侧嵌套引物引发5′端进行选择扩增,然后以第1步产物为模板,以少量的第1轮引物和第2轮引物进行特异性扩增,使特异性和效率进一步加强;将原来第2轮扩增模板浓度调整至10 ng·μL-1左右,以适合枣相关基因侧翼序列扩增。【结果】利用该体系对‘骏枣’1条626 bp的片段进行了侧翼序列扩增,获得了1条934 bp的编码富含亮氨酸重复序列的相关片段;同时以其它2条枣基因片段为起始序列进行了侧翼序列扩增,进一步验证了此技...
关键词：
枣 相关基因 SON-PCR 侧翼序列
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
耿雪侠 张立 徐敏 邓道贵 张海军
采用PCR产物直接测序法测定了3种中国常见溞属(Daphnia)动物的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基基因(COⅠ)及其侧翼序列。结果表明扩增出的线粒体DNA片段在碱基使用上存在明显偏倚,A+T含量均超过60%,且在重链上多使用T。推测3种中国溞属动物COⅠ基因的终止密码子均为不完整的终止密码子(T__),而隆线溞(D.carinata)及大型溞(D.magna)COⅠ基因的起始密码子可能是(A)CTA,较为少见。基于COⅠ基因DNA或氨基酸序列进行了同源性、进化分歧及密码子使用偏向性等方面的比较,分析结果和采用不同方法构建的分子系统进化树均显示:中国来源的两种溞属动物隆线溞与大型溞亲缘关系较近,显...
关键词：
溞属 线粒体DNA COⅠ基因 系统进化
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
欧阳叙向 黄生强 施启顺 柳小春 张明军 刘鹤翔 邓灶福 何德肆 胡述光 谭胜国
为找寻山羊FSH受体基因的SNP突变位点,进行FSH受体基因的多态性分析和探索该受体基因在山羊多胎中的可能作用,利用比较基因组学的方法,根据绵羊FSH受体基因序列设计引物,以湖南湘东黑山羊基因组为模板,PCR扩增了FSH受体基因5' 端侧翼调控区,通过克隆进行了序列测定及分析,并与牛、绵羊该区段序列进行了比较.结果表明,PCR扩增获得的片段为844 bp,与中国西门塔尔牛该段序列相比,同源性为94.08%,在-364 bp处的左翼发生了多碱基插入,湘东黑山羊该序列有5个碱基的插入,另在-625~-619 bp处的7个碱基缺失;与澳洲绵羊的FSHR基因比较,同源性为93.60%,在-367 bp...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
曲宪成 周正峰 崔严慧 刘颖 胡萍华 金一春 尚婧瑨
首先运用PCR-末端加尾法克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala)脑下垂体糖蛋白激素α亚基(Pituitary glycoprotein hormone α subunit,PGPH α)基因5’端侧翼序列;然后利用生物信息学理论对该序列进行了序列分析;最后在序列分析结果的基础上,构建了荧光素酶质粒表达载体。序列分析结果显示,克隆所得到的团头鲂PGPH α亚基基因5’端侧翼序列长1399bp;其序列中包含潜在的TATA盒、GC盒,以及ERE、TRE、CRE、PGBE等对PGPH α亚基基因转录调控起重要作用的转录因子结合位点;启动子区域位于-40~10bp处。利用PCR...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
姬云涛 曹斌云
为了研究山羊FSHR基因对产羔性状的影响,用RFLP-PCR法对多胎和单胎布尔山羊、关中奶山羊和萨能奶山羊母羊FSHR基因5′端侧翼序列进行了多态性检测。结果发现,FSHR基因5′端侧翼序列经PstⅠ、HaeⅢ、SinⅠ和TaqⅠ酶切,在多胎母羊和单胎母羊群体中均未表现出多态性;不同山羊群体FSHR基因5′端侧翼序列中各存在一些碱基的差异,但这些差异均未影响FSHR基因的转录和山羊的产羔性状。说明所检测的FSHR基因5′端侧翼序列这些酶切位点与山羊的产羔性状之间没有遗传连锁关系。
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
刘玲 刘福妹 陈肃 林琳 李慧玉 刘桂丰 姜静
以转TaLEA11个株系及野生型对照小黑杨为试材,通过生长性状、叶片解剖结构比较发现,在叶面积、气孔密度、叶片厚度等方面转基因XL11株系明显低于其他参试株系;角质层厚度、栅海比,气孔大小等方面XL11株系显著高于其他参试株系。进而以XL11株系为材料,采用TAIL-PCR方法克隆插入位点的旁侧序列得到AP2/PthRAV(XM_002311402.1)。荧光定量分析发现AP2/PthRAV的相对表达量在XL11株系中显著高于其他转基因株系及野生型平均值的7.78倍,初步认为该株系在生长及叶片解剖结构等性状的改变,可能与AP2/PthRAV上调表达有关。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
杜怡芳 朱信超 李贤慧 曲宪成
为深入研究黄鳝Dmrt1基因5′端侧翼序列在性别决定与分化中细胞通路之间的转录调控作用。本研究以黄鳝基因组DNA为模板，PCR扩增出Dmrt1基因5′端侧翼序列，并对该序列进行了生物信息学分析，然后将克隆获得的Dmrt1基因5′端侧翼序列构建到PGL3-enhancer载体中，命名为pGL3-enhancer-Dmrt1,最后将pGL3-enhancer-Dmrt1和内参质粒pRL-TK共转染至HEK293细胞，采用双荧光素酶检测系统对Dmrt1基因5′端侧翼的启动活性进行了检测。实验结果显示：克隆获得的Dmrt1基因5′端侧翼序列为1 519 bp;利用TESS-Transcription Element Search System转录因子结合位点在线预测数据库对黄鳝Dmrt1基因5′端侧翼序列进行预测分析结果表明，该序列存在AP-1、Oct-1、C/EBPa和GATAx等真核生物通用的转录因子结合位点以及与性别相关基因的蛋白结合位点，如SRY、Sox3和Sox5等；双荧光素酶检测结果显示，该5′端侧翼序列具有启动活性。
[期刊] 华北农学报
[作者]
成业 么大轩 刘云婷 胡文静 段会军
为了探讨Ｍｕ转座子使玉米发生甜质突变的分子机理，利用Ｍｕ－ＡＦＬＰ方法分离ＭｕｔＡｔｏｒ转座子插入位点的侧翼序列，并根据侧翼序列的延伸设计一对特异性引物Ｐ１、Ｐ２，验证转座子插入的真实性，同时对插入位点所在的基因进行生物信息学分析。结果显示：侧翼序列长２９９ ｂＰ，插入位点位于第３染色体，该转座子的插入属于真实插入；突变基因全长５ ７４６ ｂＰ，共编码５９２个氨基酸；所编码蛋白的理论分子量为６７．５ ｋ ＤＡ，疏水性氨基酸含量为４２．０６％，具有１０个跨膜结构域，属于亲水性内膜蛋白。该结果为更好地利用ＭｕｔＡｔｏｒ转座子创制甜玉米新种质奠定了基础，也对揭示玉米胚乳发育与淀粉合成机制具有重要意义．．．
[期刊] 中国水产科学
[作者]
白俊杰 劳海华 叶星 简清 吴淑勤
采用PCR方法从剑尾鱼(Xiphophorushelleri)线粒体基因组中扩增到1段约15.5kb的片段,测定了其中627个碱基的序列。经测序分析表明,该扩增片段包括486bp的D 环的部分序列以及D 环5'端的tRNAthr和tRNApro基因的完整序列。其中486bpD环序列包含3段保守的终止相关序列TAS、与TAS互补的序列以及类似其他鱼类线粒体CSB序列。tRNAthr由线粒体DNA的H链编码,长度为72bp。tRNApro由线粒体DNA的L链编码,长度为69bp。并绘制了这2种tRNA的二级结构图。本研究所测定的基因序列已登录国际GenBank数据库,序号为AF489918。
关键词：
剑尾鱼 线粒体DNA D-环 tRNA
[期刊] 中国农业科学
[作者]
薄惠文 俞咪娜 于俊杰 尹小乐 丁慧 王亚会 刘永锋
【目的】分析稻曲病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ ｖｉｒｅｎｓ）致病力减弱的ｔ－ｄｎａ插入突变菌株Ｂ１２４１的生物学性状和致病力，并结合分子生物学手段研究其ｔ－ｄｎａ插入位点的侧翼基因，以解析突变基因在稻曲病菌生长和致病过程中的作用，从而为阐明稻曲病菌致病机制提供理论基础。【方法】以野生菌株Ｐ１作为对照，观察并检测突变菌株Ｂ１２４１的菌落形态、生长速率、孢子形态、产孢量等生物学性状；采用注射接种的方法将菌丝和孢子的混合液接种于水稻穗苞中，统计每穗发病的病粒数，分析Ｂ１２４１的致病性变化；突变菌株Ｂ１２４１在不含有潮霉素的Ｐｓａ平板上转接５代之后，ＰＣｒ检测ｔ－ｄｎａ插入的稳定性并通过ｓｏＵｔ．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
魏进招 陈秋玲 裴忠有 孙守钧
采用农杆菌介导转化方法,将携带有GUS基因1301质粒转入日本晴水稻品种中,建立水稻T-DNA插入群体5 200个。研究表明:通过PCR和Southern Blot分析证明了再生植株为转基因植株;通过改进热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法,已成功地分离并测定了437个株系的侧翼序列;通过序列同源性分析表明,有147个序列只包含有载体序列,有214个序列中包含有与T-DNA右边界相邻的水稻基因组序列;通过水稻边界序列与网上水稻数据库中基因组序列比对,将3个突变体的T-DNA插入位点定位于水稻特定染色体上。
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