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[期刊] 华北农学报
[作者]
公鑫 王业红 张剑峰 迟胜起
RPP13是一种能够通过识别病原物效应子诱发植物免疫反应的典型R基因。植物病毒学实验室前期对马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)所侵染的5个马铃薯品种进行了转录组测序分析，发现RPP13基因在5个马铃薯品种中均上调。为了研究该基因在马铃薯中是否与PSTVd抗性相关，应用DNAMAN 8.0软件对转录组测序所得到的RPP13上调基因序列进行序列比对分析，选取其共同的保守区域作为沉默对象，构建了以该保守区域为臂，马铃薯体细胞胚发生激酶类似受体基因(SERK1)(登录号为EF175216)内含子为环的茎环结构反向重复序列RNAi载体pROKⅡ-RPP13,通过冻融法将pROKⅡ-RPP13载体转入农杆菌LBA4404中，应用农杆菌介导的马铃薯遗传转化方法转化马铃薯品种民丰红，以苗龄28 d的健康马铃薯叶片为材料，经过预培养2 d、农杆菌浸染10 min、黑暗条件下共培养2 d,应用抗性筛选培养基诱导生根、生芽，将再生植株进行PCR检测，筛选得到3株阳性转基因植株；以马铃薯的ef1a基因作为内参基因，利用实时荧光定量PCR技术检测马铃薯转化植株中RPP13基因的表达量。结果表明：所获得的3株转基因植株中RPP13基因的表达量与未转基因的对照相比具有显著差异，在所获得的RNAi转基因马铃薯植株中，RPP13基因表达量的降低幅度为35%～60%。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
张进忠 孙嘉曼 李朝生 刘挺燕 范燕萍
【目的】AGPase基因可在百合鳞茎膨大发育过程中影响淀粉的合成代谢,从而调控鳞茎发育,构建干扰AGPase基因RNAi载体并遗传转化进行反向下调作用研究,可为该调控机制的研究提供更多信息。【方法】克隆300 bp的AGPase基因保守序列,利用Gateway技术通过BP反应将该序列插入入门载体p DONR221,进行LR反应将该序列正反向插入干扰载体p Jawohl8-RNAi中,经过酶切鉴定所构建RNAi载体的正确性;并通过农杆菌介导法转入百合组培苗中,PCR检测RNAi载体转化农杆菌,荧光定量PCR检测农杆菌转化植株的AGPase相对表达量变化。【结果】成功构建p DONR221-AGPase入门克隆与p Jawohl8-RNAi-AGPase表达载体,遗传转化百合愈伤诱导出AGPase表达量下调的转化植株。【结论】采用Gateway技术可方便构建RNAi表达载体,选择的AGPase保守序列能作为干扰片段对百合AGPase自身转录的mRNA进行下调。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
杜静雅 陈凯园 普金 周会英 祝光涛 张春芝 杜慧
【目的】转基因技术的发展离不开筛选标记的完善与创新，其中的可视化筛选标记在转基因中的应用越来越广泛。近年来，经过突变获得的增强型黄绿荧光蛋白（an enhanced Yellow Green Fluorescent like Protein (eYGFP) under ultraviolet (UV),eYGFPuv(GFPuv)）在365 nm紫外光线下能够发出强烈且稳定的绿色荧光，便于观察。构建GFPuv荧光筛选的基因编辑载体，并在马铃薯遗传转化中进行应用验证，为GFPuv荧光筛选在马铃薯转化中广泛应用提供技术支持，同时为后期利用基因组编辑技术创制马铃薯雄性不育系奠定基础。【方法】利用同源重组技术将GFPuv表达框架和基因编辑元件Cas9＿sgRNA依次与pCAMBIA2300载体连接，并进行农杆菌介导的烟草瞬时转化试验；通过发根农杆菌Ar qual和MSU440转化马铃薯茎段，在便携紫外灯下观察，并统计荧光根；利用改造载体构建了6个马铃薯花药发育保守基因的编辑载体，通过发根农杆菌体系转化2种马铃薯材料，验证转化效率和编辑效率；利用改造载体对马铃薯进行遗传转化。【结果】成功构建了GFPuv荧光筛选的基因编辑载体pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas，瞬时转化烟草证实GFPuv表达框架能正常表达；2种发根农杆菌的转化均筛选到绿色荧光的毛状根，加入卡那霉素（kanamycin,Kan）显著提高阳性荧光根的比例，2种菌的转化效率差异不大，但MSU440的发根形成速度更快；6个马铃薯花药发育保守基因的编辑载体在2种马铃薯材料中的转化效率和编辑效率是一致的，但不同靶位点的编辑效率差异较大；改造载体遗传转化马铃薯证实GFPuv荧光可用于马铃薯愈伤组织和再生苗的筛选。【结论】发根农杆菌遗传转化体系是基因编辑效率验证的重要途径，GFPuv荧光可用于马铃薯转化的筛选。
[期刊] 草业科学
[作者]
张亚楠 蔺银鼎 孟林 毛培春 田小霞 郭强
重金属ATP酶基因HMA2介导的Cd长距离运输对植物体内Cd的分配及解毒起重要作用。然而,有关马蔺(Iris lactea)体内Cd长距离运输的分子机制仍不清楚。本研究以马蔺根中总RNA为模板,采用RT-PCR方法获得了重金属ATP酶基因片段,以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,采用酶切和连接的方法,构建了CaMV35S启动子驱动的含有IlHMA2基因片段反向重复序列的RNAi植物表达载体pARTG1G2,用冻融法将此重组质粒导入农杆菌GV3101,并转入到马蔺幼苗体内获得了Il
[期刊] 华北农学报
[作者]
于丛丛 马俊莲 宋春丽 陈佳
据已测序的上西早生柿ETR5基因序列,设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ETR5-Uenishiwase基因片段。2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断。连接片断经双酶切消化后,定向连接到植物表达载体pSMAK321的35S启动子和NOS终止子之间,构建成Uenishiwase-ETR5基因的RNA干扰植物表达载体。载体质粒经酶切鉴定正确后通过冻融法转入根癌农杆菌EHA101中。以上西柿组培苗叶片为外植体,优化遗传转化体系,结果表明:农杆菌重悬液和共培养基中均添加200μmol/L的AS及Spc梯度筛选能有效提高转化率。转化植株经PCR检测得到7...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
闵东红 陈阳 霍冬英 胡笛 赵月 徐兆师 张小红 李连城 陈明 马有志
干旱、高盐和病虫害严重影响了作物的产量和品质。ERF(ethylene responsive factor)转录因子是介导生物和非生物胁迫响应的重要调控因子。本实验室从小麦中克隆到抗逆相关ERF转录因子W17基因,本研究以植物表达载体pAHC25为基础,构建了含有反向重复序列的RNAi表达载体pAHC-W17RNAi。采用基因枪法45枪轰击小麦品种新春9号幼胚材料2 379个,共获得115株T0代再生植株,其中12株为阳性转基因植株。半定量RT-PCR分析表明,转基因植株中W17基因及其调控的下游基因的表达水平均显著下降;表型鉴定发现转基因小麦苗期发育受到抑制。本研究为深入分析小麦ERF基因的...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
乔亚红 田桂英 郑银英 崔百明 李诗林 向本春
【目的】利用农杆菌介导法将抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12转入红番3号加工番茄,获得抗CMV和ToMV的加工番茄植株,为加工番茄病毒病的防治奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增,选取新疆加工番茄CMV分离物NS0-4 1a复制酶第1 051-1 350bp序列和ToMV分离物SCS-2 130/180ku复制酶第1 920-2 200bp序列,作为干扰片段CR12和To12。通过T克隆载体将CR12和To12连接成拼接片段TC12,构建成含反向重复结构拼接片段的RNAi表达载体pBi35STC12。通过农杆菌介导法,用其转化红番3号加工番茄,经过筛选、PCR检测得到转...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
武小娟 吴娟 王沛捷 聂虎帅 刘杰 魏巍 马艳红
为探究马铃薯的最佳遗传转化体系，以紫色马铃薯‘华颂66号’无菌组培苗茎段为外植体，用农杆菌介导法将含有植物沉默载体质粒pBWA(V)KS-miR8019转化马铃薯外植体，测定不同预培养时间、不同激素组合及抗生素对马铃薯愈伤再生转化体系的影响。结果表明：1）茎段预培养时间为2 d时，愈伤组织诱导率最高；2）最适的外植体愈伤组织诱导的培养基配方为：MS干粉式培养基+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D，愈伤组织的诱导率为96.7%。最适愈伤组织分化的培养基为：MS干粉式培养基+4.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L GA_3;3）植株再生及生根的抗生素最适筛选浓度为75 mg/L的卡那霉素；4）农杆菌抑制剂的最适浓度为300 mg/L的特美汀，且在愈伤组织诱导、分化及生根阶段都需要加入。综上，通过对农杆菌介导的愈伤再生转化过程中各个影响因素进行试验，初步建立了马铃薯‘华颂66号’的遗传转化体系。
[期刊] 华北农学报
[作者]
朱云 郭晓 孙小磊 马伟清 董道峰 郭宝太 杨煜 杨晓慧 李广存
为了丰富马铃薯分子标记,定位青枯病抗性基因位点,利用具有抗青枯病遗传背景的二倍体马铃薯亲本USW5337.3(C)和772102.37(E)及其123份杂交一代无性系,进行了马铃薯SSR遗传图谱的构建。根据马铃薯全基因组序列设计了864对SSR引物,其中187对在亲本间表现出差异,135对(72.2%)能够在杂交一代中扩增出清晰的条带,最终构建了一张由12个连锁群组成,包含135个SSR标记的马铃薯分子标记遗传图谱。12个连锁群总长度为948.4 c M,标记间平均间距7.03 c M,含有5个标记偏分离
关键词：
二倍体 马铃薯 SSR 连锁图谱
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
包梅荣 谭晓风 乌云塔娜 张琳
为研究油茶种子成熟调控蛋白基因的功能,以pCAMBIA1304质粒为载体,根据油茶种子成熟调控蛋白基因的cDNA序列设计了小干扰RNA(Si RNA)序列,构建了油茶种子成熟调控蛋白基因小干扰RNA植物表达载体pCAMBIA1304-si RNA,并借助农杆菌介导叶盘法将pCAMBIA1304-si RNA转化到野生型烟草中,获得了稳定表达的转基因烟草苗。为下一步的油茶种子成熟调控蛋白基因的功能鉴定奠定了基础。
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
徐刚标 申响保 鲍时来 张照亮
将脂质转移蛋白(LTP4)基因插入植物表达载体pBI121—35S,构建超表达载体pBI121—35S∶∶LTP4,通过农杆菌介导法将其转入拟南芥Arabidopsis thalianaColumbia生态型品种中,获得了卡那霉素筛选的抗性植株。PCR扩增验证及RT—PCR分析表明,该基因获得超表达。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李敬娜 刘亚 李翔 袁潜华 赵久然
以pCambia3301载体为基础,以玉米Ubiquitin(Ubi)启动子、拟南芥叶绿素转运肽(Chloroplast transit pep-tide,Ctp)基因、抗草甘膦Epsps基因为元件,构建了玉米高效双元表达载体,通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404,并通过农杆菌介导法转化玉米幼胚,获得了抗草甘膦无抗生素标记的转基因玉米植株。经田间初步检测转化玉米植株具有一定的草甘膦抗性。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
向建华 高国赋 周小云 刘爱玲 邹杰 陈信波
利用拟南芥的WAX2基因序列,BLAST检索出3个水稻同源基因,分别命名为OsWAX2-1,OsWAX2-2,OsWAX2-3,与拟南芥WAX2基因的同源性分别为56.0%,55.2%,52.0%;其预测的编码蛋白与WAX2蛋白的同源性分别为61.5%,60.5%,64.7%.这3个蛋白都存在4个跨膜结构和2个固醇去饱和酶的保守区,说明这3个蛋白质都属于跨膜蛋白,并可能与角质层的蜡质合成有关.从全长cDNA数据库检索获得了3个OsWAX2的全长cDNA.以pCAMBIA-1300-multi为载体,构建了CaMV35S启动子驱动的3个OsWAX2的过表达载体pOEOSW2-1,pOEOSW2-...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
苏君艺 陆璇璇 朱维宁 张林生
【目的】利用基因枪将WZY2基因RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri导入"郑引1号"小麦,获得WZY2基因表达缺失型小麦,为深入分析WZY2基因功能奠定基础。【方法】以植物表达载体pAHC25为基础,构建含有反向重复序列的RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri,利用基因枪将其转入"郑引1号"小麦幼胚愈伤组织中,经过筛选、PCR检测得到阳性植株。【结果】从转化的1 500个愈伤组织中获得27株再生植株。利用PCR对再生植株进行检测,获得阳性植株3株,转化率为0.2%。【结论】构建了WZY2基因的RNA干扰表达载体,成功地将WZY2基因RNA干扰表达载体导入"郑引1号"小麦,获得阳性植株...
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小麦 WZY2基因 RNA干扰 遗传转化
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