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[期刊] 中国农业科学
[作者]
吴田 谢从华
【目的】研究马铃薯蛋白激酶基因StPK1,为在马铃薯抗病反应中的功能提供证据。【方法】利用TAIL-PCR技术,从马铃薯晚疫病水平抗性、垂直抗性和感病等3种材料中,分别克隆了该基因的启动子区域。此外,将从水平抗性材料中克隆得到的启动子与GUS连接构建植物表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化法转化本氏烟(Nicotiana benthamiana),将得到的转基因烟草分别用水、晚疫病原菌或水杨酸(SA)溶液处理,并进行表达活性分析。【结果】3个启动子长度分别为922、929和922 bp,均具有TATA-box和CAAT-box以及多种与抗病反应和基因时空表达有关的元件,而三者的主要差异是个别碱基...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
翟朝增 徐兆师 陈耀锋 刘沛 李连城 陈明 马有志
【目的】克隆小麦蛋白激酶基因TaNPK启动子,并分析5′非编码区对盐胁迫的响应,探索TaNPK的调控机制,为解析小麦抗盐机制提供理论依据。【方法】利用染色体步移技术从小麦中分离TaNPK读码框上游序列,构建启动子缺失突变体,在PEG4 000介导下将重组质粒转入拟南芥叶片原生质体进行瞬时表达分析,以gus为报告基因研究不同调控序列的活性及盐诱导性分析。【结果】获得了TaNPK读码框上游2 004 bp的启动子序列,PEG介导的拟南芥原生质体瞬时表达分析表明,5′端缺失片段都在不同程度上驱动了GUS的表达;经过NaCl处理后的原生质体,GUS的表达量比不经处理的对照组明显提高,这与NaCl处理下...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵艳 孙天国 王慧 张梅娟 崔巍 沙伟
【目的】克隆大豆天冬氨酸蛋白酶基因(soyAP1)启动子,并对其表达方式及活性进行分析。【方法】利用TAIL-PCR方法从大豆基因组DNA中克隆soyAP1基因启动子片段。利用启动子在线预测工具分析soyAP1基因启动子片段的启动子元件,并用克隆得到的SAP片段替换pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子,构建表达载体pCAM-SAP。通过农杆菌介导法,使其在大豆各组织中进行瞬时表达,用GUS组织化学染色法分析SAP在各组织中的表达活性。【结果】克隆获得了大豆soyAP1基因的启动子片段,长1 650bp,并将之命名为SAP,其转录起始位点可能是553bp处的A;PLACE分析表明,SA...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
周小琼 丁一琼 左丽 喻德跃
【目的】硫转运蛋白(sulfate transporter,SULTR)参与根系对外界环境中硫酸根(SO42-)的吸收与转运。大豆硫转运蛋白基因GmSULTR1;2b在根中特异表达,其功能是将外界的SO42-吸收转运到植物根系中。文章克隆大豆硫转运蛋白GmSULTR1;2b的启动子,研究该启动子的驱动活性和组织表达情况,从而了解GmSULTR1;2b的调控机制,为提高大豆含硫氨基酸含量提供分子依据。【方法】根据NCBI中GmSULTR1;2b的序列,分析预测该基因上游2 259 bp为启动子,并利用在线数据库PLACE和Plant-CARE预测该启动子序列的调控元件。以大豆品种南农N2899的...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张俊珍 刘彧 姬凯元 杨姗姗 胡帅鹏 刘学贤 范瑞文
【目的】角蛋白１０（Ｋ１０）是黑色素细胞中黑素体向周围角化细胞迁移的分子标记之一，在研究基因在黑色素细胞与角化细胞相互作用的功能时，可以作为特异的启动子。本研究欲筛选Ｋ１０较强的启动子片段，为研究Ｋ１０以及相关基因的功能提供理论依据和奠定理论基础。【方法】从小鼠尾巴提取基因组ＤＮＡ，经质量鉴定后，采用ＰＣＲ法扩增Ｋ１０的６个不同片段（Ｆ１—Ｆ６），并将其分别亚克隆到Ｐ ＭＤ１８－Ｔ载体，经测序验证是否正确；将Ｋ１０的６个亚克隆片段再克隆到Ｐ ＧＬ０载体中，产生Ｐ ＧＬ０－Ｆ１—Ｆ６构建，用脂质体法转染２９３Ｔ细胞，转染结束后将细胞裂解，并通过双荧光素酶报告基因检测６个片段转染细胞后引起的荧光素．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王丹 刘骉 胡兆农 吴文君 肖新敏 师宝君
【目的】通过克隆粘虫Mythimna separata(Walker)(Lepidoptera:Noctuidae)中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列,并分析启动子功能,为进一步探索昆虫胰蛋白酶活性调控机制奠定基础。【方法】利用Genome Walking方法克隆粘虫中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列,运用在线分析软件NNPP v.2.2和数据库JASPAR进行序列分析,构建由胰蛋白酶基因启动子驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体,通过转染草地贪夜蛾sf21细胞系,瞬时表达后用双荧光素酶报告基因检测系统分
[期刊] 华北农学报
[作者]
李孟军 高欣娜 傅晓艺 史占良 郭进考
根据普通小麦HKT1 cDNA序列(GenBank登录号:U16709)设计基因特异引物,通过筛选矮败中国春BAC文库,获得含有HKT1基因组序列单克隆BAC。根据HKT1 5'-端已知序列设计测序引物,以单克隆BAC质粒为模板进行测序,序列经Sequencer软件拼接,获得了HKT1基因起始密码子上游4 192 bp序列。用Neural Network PromoterPrediction(NNPP)软件分析此序列,预测存在9个转录起始点。PLACE软件分析表明,该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box,包含多个胁迫诱导元件,如盐诱导元件GAAAAA,抗冻、缺水、脱落酸、...
关键词：
小麦 高亲和性钾转运蛋白 启动子
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨煜 郭晓 郭宝太 杨晓慧 单伟伟 金黎平 马伟清 李广存
以高抗青枯病二倍体马铃薯基因型ED13为材料,克隆了蛋白激酶基因StPki。以StPki基因特异区段为靶标,成功构建了该基因的RNA干扰植物表达载体pCHF1-StPki。利用重组农杆菌株LBA4404(pCHF1-StPki)感染转化ED13茎段外植体,获得了抗庆大霉素的再生植株。利用CaMV35S启动子特异引物对再生植株进行PCR检测,结果表明获得了转基因植株。利用StPki基因的特异引物对转基因植株进行半定量RT-PCR分析,结果显示该基因的转录受到了抑制。马铃薯抗病基因型ED13已被成功转化,且表现出了对StPki基因的RNA干扰活性。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李广存 金黎平 谢开云 李颖 屈冬玉
【目的】克隆马铃薯蛋白酶抑制子基因StPI的全长cDNA。【方法】以马铃薯高抗青枯病二倍体基因型ED13为材料,采用RACE方法进行StPI基因全长cDNA的克隆,利用半定量RT-PCR方法进行该基因的诱导表达分析。【结果】获得了StPI基因的全长cDNA,序列分析表明:该基因具有完整的开放阅读框架,编码116个氨基酸,与马铃薯蛋白酶抑制子I前体具有较高的同源性(核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89%和74%)。该基因同时受青枯病菌的诱导和茉莉酸的调节,在6～12h内即达到最高表达水平,但二者又有明显不同。相对而言,StPI基因受青枯病菌的诱导较弱,而受茉莉酸(JA)的诱导较为强烈,在JA处理3...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李淑锋 王利祥 张大鹏 华子春
为了研究鸡局部黏着斑激酶(FAK)基因表达调控的分子机制,运用cDNA末端快速扩增技术确定了鸡胚成纤维细胞FAK基因的转录起始位点,并发现FAK基因mRNA的5′非翻译区(5′UTR)存在4种剪切形式。分析这4种剪切形式的5′端序列,发现它们都不影响蛋白的编码,但可能影响mRNA的翻译效率。另外,将启动子序列935 bp片段克隆构建到荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic中,转染鸡胚成纤维细胞,测定启动子的转录活性。通过启动子序列系列缩短的克隆,将核心启动子区定位在转录起始位点上游-662至+7的669 bp片段内,该启动子的典型特征是:没有TATA盒,而富含"GC"碱基。以上结果为FA...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
杨娇馥 史偈君 梁燕 郑旭 张涛 秦毅 王志钢 刘东军
【目的】克隆内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA并分析其基本表达模式。【方法】RT-PCR克隆AKT基因cDNA。通过在线软件BLAST进行核酸序列分析,用SMART与Psite进行氨基酸序列分析。半定量RT-PCR检测AKT基因在绒山羊组织中的表达特异性。Western blotting检测绒山羊胎儿成纤维细胞中AKT表达。【结果】克隆到的内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA片段长1 443 bp,包含了编码480个氨基酸残基的全长ORF,氨基酸序列与绵羊(NM_001161857.1)同源性为97%。SMART分析表明,ORF编码的蛋白包含了可与3-磷酸肌醇结合的PH结构域及具有丝氨酸/苏氨酸激酶...
[期刊] 华北农学报
[作者]
常雪 盛寅生 任爱芝 赵培宝
为了进一步研究分枝酸变位酶同源效应蛋白在核盘菌与植物互作过程中的作用机制,对其启动子进行了克隆和功能分析。采用启动子在线软件Promoter 2. 0和Promoter scan分析分枝酸变位酶同源基因的上游序列,寻找其启动子位点和顺式作用元件,然后通过PCR技术克隆预测启动子的DNA序列,构建荧光蛋白GFP融合载体,转化核盘菌,最后通过检测GFP荧光信号来验证启动子功能。经生物信息学分析发现,该效应蛋白基因上游具有启动子序列特征,包含TATA盒和CAAT盒等顺式元件,采用引物XS1-1和XS1-2进行PCR扩增,得到了733 bp启动子序列,序列包含相关的启动元件,然后以质粒pBlunt NAT-GFP为基础,将经PCR克隆得到的启动子(N-Pro)片段连入载体中,构建得到启动子N-Pro+GFP融合载体,通过REMI技术转化核盘菌原生质体,潮霉素筛选得到了一些转化子,PCR验证融合载体整合到了核盘菌基因组DNA上,最后经荧光显微镜检测到了菌丝GFP荧光信号,结果表明,克隆的分枝酸变位酶同源基因ATG上游733 bp的DNA序列具有启动子功能。
关键词：
核盘菌 分枝酸变位酶 效应子 启动子
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王呈玉 张明哲 吕世友 李彦舫
【目的】克隆强抗寒性牧草短芒大麦钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase,CDPK)基因,分析其生理生化特性,为理想抗逆工程基因的筛选和利用奠定基础。【方法】采用RACE-PCR技术,获得短芒大麦CDPK基因全长cDNA序列;采用Northern杂交分析该基因在逆境条件下(低温(4℃)、干旱(200 g/L PEG6000)、盐(300 mmol/L NaCl)、激素(100μmol/L ABA))的表达模式;采用农杆菌介导的方法,对该基因编码蛋白进行亚细胞定位,并对转基因烟草的离子渗漏率和脯氨酸含量进行测定。【结果】获得了短芒大麦CDPK基因的编码序列...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王莹 王晓宇 孙德慧 霍红雁 刘海臣 徐惠 张继星
为探讨蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29)在蓖麻耐盐中的作用，以蓖麻叶片为材料，设计特异性引物，克隆蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29),并对所得序列进行生物信息学分析。结果表明，蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29)序列全长1 590 bp;编码528个氨基酸；蛋白分子量为59.74 ku;等电点(pI)值6.21;是典型的非跨膜蛋白；亲水性数值为负值，属于亲水性蛋白；RcCDPK29蛋白α-螺旋占比最高有228个；RcCDPK29与拟南芥CDPK(SMTL ID:3q5i.1)相似度为40.41%,具有较高可信度(>30%)。将木薯、麻枫树、巴西橡胶树、柑橘、石榴、毛果杨与蓖麻RcCDPK29氨基酸序列进行同源性比对。其中，与麻枫树的同源性最高，为82.29%。RcCDPK29蛋白包含1个Ser/Thr蛋白激酶催化结构域和4个与Ca~(2+)结合的EF-hand型结构域。通过qRT-PCR技术，分析RcCDPK29在不同水平盐胁迫下蓖麻不同组织中的表达，结果表明，RcCDPK29基因主要在茎中表达，盐处理12 h表达量最高。随着盐处理时间的延长，RcCDPK29基因根的表达量逐渐下降，分别在2,8,24 h达到最低，与0 h差异显著；叶的表达量在2 h的表达量最低且与0 h相比差异显著。根据RcCDPK29全长设计带有SmaⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物扩增出序列全长，用SmaⅠ和XbaⅠ进行双酶切后与表达载体pCG-3300连接。成功构建了CRcCDPK29的表达载体。因此，RcCDPK29在蓖麻受到盐胁迫时起重要作用。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
李坤明 徐文腾 扶晓琴 陈松林
蛋白激酶C(PKC)广泛参与哺乳动物T、B淋巴细胞涉及的免疫反应并发挥重要作用,然而PKC在鱼类免疫过程中的作用却少有报道。本研究在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中克隆了PKC家族的典型成员PKCα(命名为CsPKCα),并进行了分子特征和表达模式分析。CsPKCα的cDNA全长为2315 bp,其中,开放阅读框(ORF)为2013 bp。qRT-PCR分析显示,CsPKCα在各个组织中广泛表达,其中,在鳃、肝脏、皮肤和肠中具有较高的转录水平,表明CsPKCα可能在免疫过程中发挥作用。随后检测了CsPKCα在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染后6种免疫相关组织(鳃、肝脏、皮肤、肠、脾脏和肾)中不同时间点的表达水平,发现细菌侵染后24 h或48 h,CsPKCα在鳃、肾脏、皮肤和脾脏中显著上调,侵染后12 h在肝中有显著性下调。研究表明,CsPKCα可能在应对哈维氏弧菌的免疫应答中发挥作用,但是否参与病原菌侵染的巨噬细胞激活以及与T、B细胞相关的信号通路还需要进一步研究。这是关于PKCα参与鱼类细菌性免疫反应的首次报道。
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