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[期刊] 华北农学报
[作者]
卢其能 杨清 沈春修
根据茄科植物花色苷生物合成相关基因的资料,设计简并引物,通过RT-PCR的方法从马铃薯(Solanum tuberosumcv.Chieftain)紫色芽的cDNA中克隆到类黄酮-3-O-葡萄糖基化酶基因(3GT)的全长cDNA。序列分析表明,这个3GT基因编码的多肽为448个氨基酸残基,在氨基酸水平上与茄科的矮牵牛和茄子的一致性最高,均为76%,多重比较和系统发育分析均表明,该基因为3GT家族中的一个新成员。用半定量RT-PCR进行了表达分析表明,3GT在根、叶和块茎中的表达量远高于茎和花;此外,3GT在Chieftain的红色愈伤组织中表达而在非红色愈伤组织中不表达,可见,3GT的表达与花...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
陈蒙 刘海峰
为探究5GT基因在山葡萄花色苷合成过程中的表达规律及作用,以山葡萄(Vitis amurensis)为材料,利用RT-PCR技术克隆山葡萄5GT基因的全长cDNA序列(GenBank登录号为GU237133),将该基因命名为Vam5GT并对该蛋白进行生物信息学分析预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测Vam5GT基因在山葡萄8个不同转色时期的表达规律,将克隆获得的Vam5GT基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli Bl2(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物。并构建表达载体pC5GT并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化。结果显示:克隆获得的Vam5GT cDNA全长1 497 bp,开放阅读框1 347 bp,编码448个氨基酸,该基因表达产物相对分子质量为49.84 ku,等电点为5.23,是不稳定蛋白。该基因属于UDPGT超基因家族,不包含信号肽。Vam5GT在山葡萄花后4周的果皮中表达丰度最高,其他时期表达逐渐下降;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,在含50 mg/L Kanomycin的培养基上对拟南芥T_0代种子进行筛选,先后得到2个阳性幼苗,转化率为0.05%。对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性。
[期刊] 草业科学
[作者]
杜灵娟 陈凯利 刘雅莉
花青素3-O-葡糖基转移酶(3GT)是花青素苷合成最后一步的关键酶,可把不稳定的花青素催化成花青素苷。本研究利用PCR技术从蓝色葡萄风信子‘亚美尼亚’(Muscari armeniacum)中克隆到一个3GT基因(Ma3GT),Ma3GT cDNA全长1 377bp,编码458个氨基酸,与其他植物的3GT蛋白序列相似性达55%64%。进化分析表明,Ma3GT与单子叶植物3GT聚为一类,与小苍兰(Freesia hybrida)、荷兰鸢尾(Iris hollandica)3GT亲缘关系最近。荧光定量PCR分
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘娜 田雨菁 冯哲瀚 李虎良 张蕾 黄金海 华德平
为研究蓝莓3-O-葡萄糖基转移酶基因(3GT)的性质和功能，探明3-O-葡萄糖基转移酶在花青素合成过程中发挥的作用，以成熟的蓝莓果实为材料，利用同源克隆获得了3GT基因的单一拷贝，运用生物信息学软件分析预测蓝莓3GT的序列特征。结果表明：3GT基因长度为1 371 bp,编码456个氨基酸，位于蓝莓的4号染色体末端，含有3个外显子和2个内含子。蛋白的分子式为C_(2279)H_(3521)N_(595)O_(650)S_(15),理论等电点(pI)为6.14。信息分析预测3GT蛋白有37个磷酸化位点，亲水指数小于0为亲水性蛋白，不稳定系数大于40为不稳定蛋白，无跨膜区和信号肽；蛋白质二级结构由α-螺旋(Hh)、延伸链(Ee)、β-转角(Tt)和无规则卷曲(Cc)4种结构形式组成，其中α-螺旋占比最高，达40%;3GT属植物糖基转移酶家族(GTB-型),PSPG结构域中第44位是组氨酸，糖基供体可能为UDP-半乳糖；与猕猴桃亲缘关系最近，同源性为67%;分子对接显示蓝莓3GT与矢车菊素分子存在4种相互作用力；蓝莓3GT启动子上游可能具有与光响应、抗胁迫响应及特定激素响应相关的顺式作用元件。本研究克隆得到了蓝莓3GT基因，通过在线网站和预测软件对其进行了生物信息学分析和功能预测。
关键词：
蓝莓 3GT 基因特征分析 花青素合成
[期刊] 西南农业学报
[作者]
张聪 郑雪莲 蒲志刚 吴洁 王大一 阎文昭
ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化ADP-葡萄糖合成反应,是淀粉生物合成的限速酶之一。从高淀粉甘薯品种川薯34总RNA逆转录的cDNA中克隆了AGPa1和AGPa2两个α亚基编码序列,进行生物信息学分析后,插入植物高效表达载体pCamb ia1301构建了pC-AGPa1和pC-AGPa2两个双元表达载体,并导入根癌农杆菌EHA105中。获得的工程菌菌株可用于遗传转化甘薯、马铃薯和木薯等重要的薯类作物,为薯类作物高淀粉育种奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李婷 练森 李保华 梁文星 王彩霞
为探究苹果树腐烂病菌β-葡萄糖苷酶基因VmGluI的序列特征及其在病菌侵染致病过程中的表达,以强致病力菌株LXS080601为材料,利用RT-PCR技术克隆基因c DNA序列,通过生物信息学软件对VmGluI编码蛋白的系统进化关系、理化性质和二级结构进行分析,采用实时荧光定量PCR技术测定VmGluI的表达量。结果显示,苹果树腐烂病菌VmGluI的开放阅读框为1 689 bp(GenBank登录号KY646110),编码562个氨基酸,蛋白分子量62.7 k Da。VmGluI编码的蛋白具有糖基水解酶1家
[期刊] 华北农学报
[作者]
王海波 李芙蓉 杨金翠 高永 郭俊云
为了探究磷酸葡萄糖变位酶(PGM)在植物蔗糖与淀粉代谢中的重要作用,基于同源序列比对的方法,在小桐子基因组中鉴定到1个细胞质型PGM基因(命名为JccPGM)与1个叶绿体型PGM基因(命名为JcpPGM),利用qRT-PCR方法检测JccPGM与JcpPGM基因在小桐子不同器官与低温条件下的表达特性,同时,构建了pGEX-4T-1-JccPGM与pGEX-4T-1-JcpPGM原核表达载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达分析。结果表明:两者分别编码582,637 aa的蛋白质。聚类分析表明,小桐子pPGM在其N端包含叶绿体定位信号肽,而cPGM较pPGM多4段肽链序列-~(108)VGVDGS~(113)-、-~(183)SGPE~(186)-、-~(283)GKSNSE~(288)-、-~(470)SLGEVN~(475)-。qRT-PCR表达分析显示,小桐子cPGM与pPGM基因都在叶片中高表达,而在根与种子中表达量较低。通过BL21(DE3)诱导表达,分别得到90.7,97.0 ku的蛋白条带,与理论融合蛋白的分子量一致。综上所述,本研究为开展小桐子cPGM与pPGM基因表达蛋白的功能分析以及其在蔗糖与淀粉积累、逆境应答中的机制研究奠定了基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘薇 赵云 安金玲 王茂林
【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus L.)矮化突变体"NDF-1"和野生型近等基因系亲本"3529"中ADP-核糖基化因子(ADP-ribosylation factor,ARF)基因全长cDNA,分析矮化突变体中该基因在不同组织中的表达水平,探讨矮化突变体中该基因在甘蓝型油菜茎杆发育过程中的作用。【方法】采用SSH(suppression subtractive hybridization)、RACE(rapid-amplification of cDNA ends)和RT-PCR技术,克隆甘蓝型油菜矮化突变体"NDF-1"和野生型"3529"中的ARF基因的全长cDNA序...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
徐晶 梁旭方 蔡文静 高俊杰 旷玉兰 魏君冉 何珊
为了探讨6-磷酸葡萄糖酶催化亚基(glucose-6-phosphatase catalytic subunit,G6PC)在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)糖代谢中的作用,采用同源序列比对的方式,在草鱼基因组中获取了3个g6pc基因的序列,通过序列比对和进化树分析,将其分别命名为g6pca、g6pcb1和g6pcb2,其编码的氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和人(Homo sapiens)具有较高的同源性,相似度分别为85%～94%、64%～83%和54%～66%。同线性分析表明g6pc在草鱼染色体上的分布与斑马鱼等高度相似,表明草鱼g6pc基因在进化中具有较高的保守性。利用RT-PCR检测3个基因在鳃、脂肪、脑、心脏、肝、肾、前肠、中肠、后肠和肌肉10个组织中的表达,结果显示, g6pca在脑和肝中表达量较高,脂肪组织次之; g6pcb1在肝中表达量最高,中肠次之; g6pcb2在心脏表达量最高,其次为脂肪组织。同时探讨了高糖饲料对草鱼不同g6pc亚型转录水平的影响,以及不同浓度葡萄糖和胰岛素刺激草鱼肝细胞(L8824)后对g6pca转录水平的影响。结果显示,饲喂高糖饲料(7周)后,与对照组相比,草鱼肝脏g6pca mRNA水平显著升高, g6pcb1和g6pcb2 mRNA水平无显著变化。离体情况,与5 mmol/L葡萄糖组相比,15 mmol/L葡萄糖显著增加了L8824的g6pca mRNA水平,且1 mol/L胰岛素可以抑制这种作用; 30 mmol/L葡萄糖对L8824 g6pca mRNA水平无显著性影响。本研究表明,草鱼g6pc发生加倍后存在功能分化,高糖可以诱导g6pca mRNA的表达,而对g6pcb1和g6pcb2的转录水平无影响,其具体功能还需进一步研究。
关键词：
草鱼 g6pc 糖异生 组织表达 胰岛素
[期刊] 西南农业学报
[作者]
陆坚 路卫卫 李伟亮 郭晓敏 杜丽琴 韦宇拓 黄日波
【目的】通过宏基因组技术获取土壤微生物总DNA,运用基因克隆、功能筛选、基因表达等手段挖掘新型β-葡萄糖苷酶,为新型微生物资源的开发利用提供科学依据。【方法】提取高糖土壤宏基因组DNA,构建宏基因组文库;筛选文库并对阳性克隆子亚克隆,获得β-葡萄糖苷酶基因;PCR扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌进行表达;采用镍亲和层析对重组酶纯化,研究其酶学性质。【结果】成功构建约含9.2万个克隆的高糖土壤宏基因组文库,获得一个新型β-葡萄糖苷酶基因unbgl3A。该基因大小为2241 bp,在氨基酸水平上,与Gen Bank数据库中已知β-葡萄糖苷酶的一致性为73%;该酶最适pH为6.0,最适温度为50℃,对对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)的K_m值为6.45 m M,V_(max)为50μmol/(mg·min)。在15～50℃热处理1 h后仍保留90%以上的酶活力,热稳定性较好,且被多种糖激活。【结论】宏基因组技术是获取新酶有效手段,获得的Unbgl3A具有良好酶学性质,可为进一步挖掘其应用潜力及研究耐热机理奠定基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
许海峰 刘静轩 王意程 左卫芳 曲常志 王得云 张静 姜生辉 王楠 陈学森
【目的】研究新疆红肉苹果杂种一代优系‘红脆１号’液泡膜葡萄糖转运蛋白基因ＭｄＶＧＴ１生物学信息、表达水平及其在糖代谢中的功能，旨在为进一步完善功能型苹果育种的理论与技术体系提供参考。【方法】以新疆红肉苹果杂种一代优系‘红脆１号’为试材，克隆ＭｄＶＧＴ１，对其进行生物信息学分析；并采用荧光定量ＰＣＲ分析该基因在不同组织及不同发育时期的表达，分析‘嘎啦’组培苗中该基因在葡萄糖诱导下的表达，通过酵母双杂交验证其互作关系，并通过原核诱导获得重组蛋白。【结果】在‘红脆１号’中克隆获得ＭｄＶＧＴ１全长，测序发现其包含１ ５０６ ｂＰ完整的开放阅读框，编码５０１个氨基酸，预测其编码蛋白质分子量为５３．１６ ．．．
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
魏跃 陈啸寅 李振陆 王永平 史建磊 吴志明 张蜀宁 陈劲枫
以黄瓜品种露丰为材料,根据已报道的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6PGDH)的保守氨基酸序列设计简并引物,利用RT-PCR技术获得黄瓜6PGDH的cDNA同源片段,命名为CSPG(登录号为EU815934)。该片段长度为1 207 bp,包含一个936 bp的开放阅读框(编码311个氨基酸)和271 bp的Poly A 3′非翻译区末端,无内含子;该基因编码的氨基酸序列与拟南芥、大豆、水稻、玉米、菠菜的6PGDH基因有75%以上的同源性。运用半定量RT-PCR技术对6PGDH基因的转录水平进行分析,结果表明:该基因在叶、根、茎中均有表达,高温胁迫下的表达量高于常温对照,说明6PGDH基因与热胁迫...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
潘凤英 曲俊杰 刘露露 孙大运 郭泽西 韦晓丽 韦淑梅 尹玲
【目的】克隆葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）糖基水解酶（glycosyl hydrolase,GH）基因（PvGH），分析其特征以及在葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中的表达模式，研究其抑制/促进烟草叶片程序性细胞死亡（PCD）以及影响烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）侵染的能力，为深入探究调控寄主植物免疫的机制提供理论依据。【方法】以葡萄霜霉菌Pv5-27菌株作为试材，采用RT-PCR方法扩增获得8个PvGH基因全长，并对其基因及编码蛋白进行生物信息学分析；利用酵母信号肽诱捕系统（SST）验证PvGH的分泌活性；利用实时荧光定量PCR技术检测葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中PvGH的表达模式；同时利用农杆菌介导的PVX病毒表达系统在本氏烟上瞬时表达PvGH效应蛋白，分析其对INF1和BAX触发的烟草PCD的抑制能力以及促进烟草疫霉侵染的能力。【结果】8个PvGH基因序列与通过全基因组预测的序列完全一致，长度为1 092—1 392 bp，分别编码364—464个氨基酸，与其他卵菌同源蛋白相似性高达60.62%—86.36%。8个PvGH均不含跨膜结构域，其二级结构差异较大，三级结构与其他蛋白三级结构相似性较低，呈现非常独特的三级结构。使用SingalP 5.0软件对编码的蛋白进行信号肽预测，发现它们均含有20—26 aa的信号肽，但通过SST验证结果显示PvG09279和PvG13517并不具有分泌特性。保留、缺失或者替换信号肽的8个PvGH均可抑制BAX触发的本氏烟PCD，并促进烟草疫霉的侵染，表明PvGH效应蛋白发挥其毒力不依赖于信号肽。PvGH在葡萄霜霉菌侵染初期表达上调，进一步表明其在病原菌与寄主互作中的重要作用。【结论】在侵染寄主过程中，葡萄霜霉菌分泌的PvGH通过抑制寄主PTI反应参与致病过程。
[期刊] 华北农学报
[作者]
冯睿杰 侯丽霞 郭扬 马倩 刘新
为了研究葡萄肌醇半乳糖苷合成酶基因家族的特性,以抗低温品种左优红组培苗为材料,通过同源克隆技术,获得VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4全长CDS,对其序列进行了生物信息学分析,同时利用实时定量PCR技术探究了3个基因的组织表达特性和响应逆境因子及相关信号分子的特性。结果显示:3个基因c DNA大小分别为954,978,1 011 bp,分别编码317,325,336个氨基酸序列;3个蛋白分子量分别为36.65,36.97,38.12 k Da;等电点分别为5.12,5.33和5.16,且均在C
[期刊] 中国农业科学
[作者]
马成英 吕海鹏 林智 张悦 郭丽 谭俊峰
【目的】克隆茶树(Camellia sinensis)的一个类黄酮O-甲基转移酶基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究其酶学特性和调控茶树中甲基化类黄酮物质的代谢机理奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得该基因cDNA全长,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。【结果】该基因cDNA全长为1 246 bp,其开放阅读框为1 077 bp,编码358个氨基酸,推测的蛋白分子量为40.2 kD,理论等电点为5.62;...
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