马铃薯是世界性粮蔬作物。致病疫霉引起的晚疫病则是马铃薯育种所面临的最严峻问题之一,因此,分离和利用马铃薯晚疫病抗性基因获得抗病新品种是马铃薯育种的重要目标。首先在连翘中发现的一类与木质素合成相关的Dirigent基因可能在植物抗病虫害过程中起重要作用。试验根据马铃薯的EST序列信息设计特异性引物,并通过RT-PCR和RACE技术获得了一条全长为729 bp的Dirigent基因cDNA序列,命名为StDIR1;该cDNA编码一个包含191个氨基酸的蛋白质多肽;系统进化分析表明,该多肽是一种Dirigent-like蛋白,属于DIR-b亚群,与陆地棉Di-rigent-like protein ...

将类甜蛋白基因 (TLP)及其紧密连锁的抗除草剂bar基因以农杆菌介导法导入脱毒微型种薯“津引薯 8号” ,经除草剂筛选后的转基因单株无性繁殖用于分子检测 ,标记基因bar基因的PCR反应和含TLP基因特异探针的Southern检测结果 ,转基因植株分别显示出 0 54kb和 3 0kb的特异性条带 ,证明TLP基因已成功地整合到转基因马铃薯基因组中。利用TLP基因特异性抗血清对转基因植株进行Western反应检测 ,结果表明 ,转基因植株中TLP基因表达量显著高于对照组 ,经晚疫病菌游离孢子接种离体抗性分析 ,转基因株系表现出对晚疫病的明显抑制作用和症状发生的延迟作用

为了探究来源于马铃薯中的StBAG3基因在马铃薯抗性建立过程中可能具有的功能,以夏坡蒂马铃薯的离体叶片为试验材料,利用马铃薯的瞬时表达体系对StBAG3基因的功能进行了初步的研究。结果表明,在瞬时表达StBAG3基因的马铃薯离体叶片上人工接种马铃薯晚疫病菌,24,48,72,96 h后接种位置病斑的相对面积较对照病斑显著减少了1.92～39.15百分点,说明瞬时表达StBAG3基因后显著提高了马铃薯对晚疫病菌的抗性水平。这一结果也从对接种部位坏死细胞的染色中得到了证实。H_2O_2定性和定量测定的结果表明,瞬时表达StBAG3基因后接种部位H_20_2积累量在接种后0～48 h差异不显著,接种后72,96 h与对照差异显著,二者均在72 h达到最大值,分别为0.146,0.086μmol/g。ROS清除酶活性测定的结果表明,接种后瞬时表达StBAG3基因部位SOD和CAT的活性随着接种时间推移,变化的模式有所差异,但二者在0～96 h均高于对照叶片,而POD的活性在接种后0～72 h与对照叶片没有显著差异,仅在接种后96 h显著高于对照叶片,间接证明了H_2O_2参与了StBAG3基因介导的正向调控马铃薯对晚疫病的抗性建立过程。由此可见,StBAG3基因能够提高马铃薯对晚疫病的抗性水平。

【目的】从高抗PVY烟草品种VAM中克隆抗病相关基因,分析该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在烟草抗PVY防御反应中的作用,为培育抗PVY烟草新品种奠定基础。【方法】利用SSH结合cDNA芯片筛选出来的病害诱导特异表达基因片段,通过RACE技术克隆烟草抗病相关基因;生物信息学分析该基因保守结构域以及序列特征;采用MEGA4.0软件构建系统进化树;利用实时荧光定量RT-PCR技术研究该基因的表达特性。【结果】克隆了1个烟草抗病相关基因,命名为NtPsaN,该基因具有PsaN基因家族保守结构域,OFR长度507bp,编码168个氨基酸;构建了PsaN亚基系统进化树;实时荧光定量RT-PC...

【目的】研究马铃薯中过表达三七PnSS基因对早疫病抗性的影响。【方法】从三七叶中克隆PnSS基因，使用邻接法构建三七PnSS及其同源物的系统发育树，通过农杆菌介导法转化马铃薯“剑川红”,随机挑选2个转基因株系在自然条件下接种病原菌交链格孢(Alternaria alternata)并统计病情指数，利用PCR方法检测生长素基因StYUCCA8、StPIN1和StPIN2的表达水平。【结果】从三七中克隆PnSS基因，系统发育树显示三七PnSS基因与西洋参中的同源物处于同一聚类中，但与茄科植物的同源物处于不同的聚类。三七PnSS基因转化马铃薯后获得12个转基因株系，随机挑选2个株系并接种交链格孢，发现表达PnSS的转基因马铃薯植株对早疫病显示出抗性，进一步发现StYUCCA8和StPIN2的表达水平在转基因马铃薯接种交链格孢前后均降低，StPIN1的表达水平在转基因植株接种交链格孢前升高，而接种交链格孢后降低。【结论】PnSS基因的过表达降低了生长素基因StYUCCA8、StPIN1和StPIN2的表达而提高马铃薯对早疫病的抗性，为利用PnSS基因开展马铃薯育种并获得抗早疫病马铃薯品种建立理论基础。

【目的】研究马铃薯中过表达三七PnSS基因对早疫病抗性的影响。【方法】从三七叶中克隆PnSS基因，使用邻接法构建三七PnSS及其同源物的系统发育树，通过农杆菌介导法转化马铃薯“剑川红”，随机挑选2个转基因株系在自然条件下接种病原菌交链格孢Alternaria alternata，统计病情指数，利用PCR方法检测生长素基因StYUCCA8、StPIN1和StPIN2的表达水平。【结果】从三七中克隆到PnSS基因，系统发育树显示三七PnSS与西洋参中的同源物处于同一聚类中，但与茄科植物的同源物处于不同的聚类。三七PnSS基因转化马铃薯后获得12个转基因株系，随机挑选2个株系并接种交链格孢，发现表达PnSS的转基因马铃薯植株对早疫病显示出抗性，进一步发现StYUCCA8和StPIN2的表达水平在转基因马铃薯接种交链格孢前后均降低，StPIN1的表达水平在转基因植株接种交链格孢前升高，而接种交链格孢后降低。【结论】PnSS基因的过表达降低了生长素基因StYUCCA8、StPIN1和StPIN2的表达而提高马铃薯对早疫病的抗性，这为利用PnSS基因开展马铃薯育种并获得抗早疫病马铃薯品种建立了理论基础。

通过改进外植体处理方法、添加乙酰丁香酮提高外植体芽分化频率、筛选芽分化培养基中激素浓度和确定 转化后再生体系的筛选物质及其使用浓度等方法建立和优化了马铃薯脱毒微型种薯的根癌农杆菌遗传转化体系。 利用该体系将水稻类甜蛋白基因和水稻几丁质酶基因导入津引薯8号脱毒微型种薯中,并获得转基因株系。通过 PCR和southern杂交分子检测,证明ZGY-298,ZGY-283和ZGY-301 3个株系均整合了这2个基因。采用晚疫 病主要生理混合小种温室活体接种和离体接种进行抗病性分析表明,在晚疫病发病高峰期(接种后5-6 d)。转基因 株系对晚疫病抗性明显高于对照品种,并可使病情蔓延推迟2-3 d。

花色苷是植物次生代谢过程中产生的黄酮类物质，在花色苷合成途径中，花色苷合成酶催化无色花色苷转化成有色的花色苷，在植物器官着色过程中起重要作用。为了解彩色马铃薯花色苷合成途径中关键酶基因ANS的功能，以红皮红肉的彩色马铃薯品种红美为试验材料，利用RT-PCR技术克隆花色苷合成酶基因，通过生物信息学分析其特性，并将其过表达到拟南芥中进行功能验证。结果显示，该基因cDNA序列长为1 406 bp,包含1 368 bp完整的开放阅读框，编码455个氨基酸残基。通过生物信息学分析克隆到的基因，并将该基因命名为StANS1a,GenBank登录号为ON512347,其氨基酸序列具有保守的结构域DIOX＿N和2OG＿FeⅡ＿Oxy,分别位于氨基酸序列的52～166位和215～312位。在拟南芥中过表达StANS1a,通过半定量RT-PCR检测其转录水平，转基因株系中都有StANS1a基因的表达，且表达量较非转基因拟南芥高；通过检测转基因植株中花色苷的含量，发现转基因植株花色苷含量比非转基因植株高2.17%～54.61%,表明StANS1a参与了花色苷的生物合成。同时也证明彩色马铃薯StANS1a基因在花色苷代谢途径中起着重要的作用。

设计简并引物,用RT-PCR法从马铃薯野生种(Solanum pinnatisectum)克隆到了CHS(Chalcone synthase,查尔酮合酶)基因的全长cDNA,并用半定量RT-PCR法进行了表达分析。序列分析表明,CHS基因编码一个389个氨基酸残基的多肽,在氨基酸水平上与其他茄科植物的同源性达到89%~93%,多重比较和系统发育分析均表明该基因为CHS家族中的一个新成员;检测了CHS基因的空间表达模式,该基因在花和匍匐茎中表达量最高,在根和块茎中没有检测到,这与花和匍匐茎呈淡紫色有花色苷合成,而根和块茎呈白色无花色苷合成是相一致的;发现在块茎中CHS受光诱导表达,光照后的第3天...

【目的】利用马铃薯抗晚疫病种质资源筛选晚疫病抗病基因，为马铃薯晚疫病抗性育种提供理论基础。【方法】基于转录组测序技术，分析20个具有持续强抗晚疫病的马铃薯品种/品系和3个易感晚疫病品种的抗、感差异表达基因，利用GO数据库预测差异表达基因的功能、Clustal Omega程序比对氨基酸序列、MEGA6构建氨基酸序列进化树及SMART和HMMER程序分析蛋白结构域。【结果】对比3个易感晚疫病品种，20持续强抗病材料间具有共性上调或下调表达的基因，筛选到转录水平相差2倍的上调基因有6，034个、下调基因4，611个；GO分析表明，在表达上调的基因中，有508个基因的表达产物参与转录调控，1，084个基因的表达产物拥有ATP结合功能，1，179个基因的表达产物位于细胞核内发挥功能。在这些差异表达的基因中，分别有313个及111个基因表达量相差10倍上调或下调，其中在表达水平极调的基因中，有3个cc-NBS-LRR类基因与已克隆的晚疫病抗性基因有相似的蛋白结构域，其中，PGSC0003DMP400034099基因由876个氨基酸组成，与Rpi-amr3i基因的亲缘关系较近，其内部有9个LRR结构域，而Rpi-amr3i基因内部只有4个LRR结构域；PGSC0003DMP400045185基因由911个氨基酸组成，与Rpi-amr3i、R1-A、R8以及Rpi-blb2基因的亲缘关系较近，其内部的LRR结构域比Rpi-amr3i、R1-A、R8和Rpi-blb2多，且包含MeaB和Hc1结构域；PGSC0003DMP400042154基因由888个氨基酸组成，与Rpi-vnt1基因的3个转录本亲缘关系较近，内部都含有1个ABC transporter结构域，3个LRR结构域，Rpi-vnt13个转录本内只有1个LRR结构域。【结论】在20个具有持续强抗晚疫病特性的马铃薯品种/品系中筛选到大量差异表达的基因，其中极显著上调表达的cc-NBS-LRR类基因PGSC0003DMP400034099、PGSC0003DMP400045185和PGSC0003DMP400042154与已知晚疫病抗性功能基因的具有相同的保守性分子结构，可能参与马铃薯持续强抗晚疫病。

【目的】获得大豆疫霉根腐病抗性相关基因,为培育大豆抗病品种提供理论依据。【方法】在以大豆抗病品种绥农10构建的受疫霉菌诱导后差异表达的cDNA消减文库的基础上,选取文库中一条与其它植物的DR1基因具有较高同源性且上调表达的EST序列。通过RT-PCR方法从绥农10中克隆该基因,并构建到植物表达载体pCAMBIA3301上,以感病品种东农50的子叶节为外植体通过根癌农杆菌介导的方法进行大豆遗传转化。【结果】该基因全长805 bp,开放读码框为471 bp,编码156个氨基酸,在此命名为SDR1。遗传转化获得转基因PCR鉴定阳性植株5株,Real-time PCR检测T1转基因植株较非转基因植株S...

为了研究马铃薯内源BAG基因在晚疫病抗性建立中的作用,利用拟南芥和水稻的BAG基因保守序列,在马铃薯基因库中比对获得马铃薯内源StBAG3的基因序列。以StBAG3基因序列为模板设计引物,通过RT-PCR克隆得到了StBAG3基因cDNA序列。序列分析的结果表明,该基因开放阅读框为1026bp,编码341个氨基酸。蛋白二级结构预测结果表明,StBAG3具有UBQ和BAG2个保守功能域。StBAG3基因的表达谱分析结果显示,不同马铃薯品种中StBAG3基因表达水平存在差异,其中在冀张薯12号中表达量最高,而

以马铃薯原始栽培种Yan(S.tuberosum subsp.andigena var.yanacochense)为材料,采用同源克隆技术,得到1条800 bp的c DNA片段。该c DNA片段包含1个完整的开放阅读框,编码265个氨基酸长度的蛋白质,定位在马铃薯10号染色体上。在线氨基酸序列分析、原生质体转化核定位分析和定量PCR表达特异性分析结果表明,该蛋白与番茄Sl CMYB1、茄子Sm MYB的同源性达99%,与拟南芥At MYB113的同源性在70%以上;该蛋白含有2个DNA–结合结构域,是2个串联的myb–功能域,属于R2R3类MYB转录因子,命名为StR2R3–MYB1。StR2...

天然抗性相关巨噬蛋白(Nramp)家族是一类抑制胞内寄生菌侵染的天然免疫相关蛋白。本研究克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)Nramp基因并进行了表达分析。该基因cDNA序列全长为3 158 bp,编码1个含544个氨基酸的蛋白。该蛋白含有Nramp家族的特征序列:包含12个跨膜区(TM)、1个由20个氨基酸残基组成的胞质内转运结构域(CTM)。草鱼Nramp同其他16个物种的Nramp氨基酸序列同源性在62.5%～90.2%之间。草鱼Nramp基因cDNA的独特结构是其3′末端非翻译区(UTR)和5′UTR各有1个脊椎动物Nramp2中的铁反应控制蛋白结合位点(IR...