[目的]对马泰勒虫棒状体颈部蛋白2(RON2)进行原核表达和生物信息学分析,为后续蛋白互作试验提供材料基础。[方法]以马泰勒虫新疆分离株为研究对象,克隆其RON2基因,并与GenBank中已知的马泰勒虫美国WA株基因组数据和顶复门原虫RON2基因序列本地数据库进行BLAST比对,确定其进化关系。构建重组表达载体pET-32a-RON2,融合表达重组蛋白,对RON2基因编码蛋白进行生物信息学分析。[结果]马泰勒虫新疆株RON2基因(NCBI登录号MT939257)长3 920 bp,高度保守,与顶复门原虫RON2基因核苷酸和氨基酸序列的相似性分别为31.2%～82.7%和23.8%～79.5%。成功构建原核表达重组质粒,获得的RON2融合重组蛋白分子质量为26 ku,为包涵体蛋白。生物信息学分析表明,RON2蛋白是一种碱性、不稳定亲水性跨膜蛋白,二级结构以α螺旋为主,亲水性较差,抗原性较弱,与其他顶复门原虫RON2蛋白具有相似的三级空间特殊结构和氨基酸序列,且可能与其他入侵蛋白存在相互作用关系。[结论]获得马泰勒虫新疆株RON2基因,诱导表达获得部分RON2融合重组蛋白,该蛋白存在与其他入侵相关蛋白相互作用的位点,可能参与了虫体入侵宿主细胞的过程。

[目的]对月季Ⅲ型聚酮合酶基因(RcPKSⅢ)进行生物信息学和原核表达分析,为进一步探究该基因的催化功能奠定基础。[方法]以‘月月粉’花瓣为研究材料,从其基因组中筛选月季PKS基因(RcPKSs)家族成员,并对其进行生物信息学分析;利用MEGA软件对RcPKSs与其他植物PKS氨基酸序列进行系统发育分析;利用DNAMAN软件对RcPKSs和紫花苜蓿查尔酮合酶2(CHS2)基因进行序列比对分析;对RcPKSs和紫花苜蓿CHS2活性位点上的氨基酸残基进行比较,分析其催化特征;利用SWISS-MODEL对RcPKSs进行同源建模,并与紫花苜蓿CHS2蛋白三维结构进行比较。利用实时荧光定量PCR方法,分析RcPK Ss和间苯三酚甲基化酶编码基因在‘月月粉’花蕾期、半开期和盛开期的表达模式;克隆RcPKSs基因全长,构建其原核表达载体pET-3 2a-RcPKSs,进行诱导表达,并对重组蛋白进行纯化。[结果]从‘月月粉’基因组中共鉴定出6个RcPKSs,生物信息学分析表明,RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3为CHS基因,RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6为新型PKSⅢ基因。系统发育分析表明,RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3编码CHS蛋白,RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6编码新型的非CHS蛋白。序列比对分析表明,RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3蛋白与紫花苜蓿CHS2相似度均为72.16%,RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6与紫花苜蓿CHS2相似度分别为67.52%,33.85%和32.73%。活性位点上氨基酸残基比较发现,RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3活性位点上氨基酸残基均保守,RcPKS4氨基酸残基在起始口袋和延伸口袋处发生替换,RcPKS5和RcPKS6氨基酸残基均在延伸口袋处发生替换。对RcPKSs蛋白质结构的分析结果显示,RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6蛋白质采用了几乎相同的αβαβα三维整体折叠形式。实时荧光定量分析表明,RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6表达量在‘月月粉’花朵盛开期最高,间苯三酚O-甲基转移酶基因(POMT)、苔黑酚O-甲基转移酶基因1(OOMT1)和OOMT2表达量在盛开期最低。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果表明,重组蛋白诱导并且纯化成功。[结论]鉴定了‘月月粉’新型RcPKSⅢ基因,该基因可能参与花发育调控过程。克隆了RcPKSs基因,并诱导表达获得了RcPKSs重组蛋白。

为了深入研究2-Cys Prx基因调控桃果实氧化还原信号分子作用机制,结合了PCR技术和RT-PCR技术通过体外克隆的方法得到桃果实2-Cys Prx基因,通过对序列分析表明,2-Cys Prx基因全长1 424 bp,其中,编码区813 bp,共编码270个氨基酸。对其分子结构进行分析,2-Cys Prx蛋白分子量为29.7 ku,为疏水型蛋白,且是膜外蛋白。在线软件预测2-Cys Prx蛋白分子式为C1342H2110N348O403S4,分子量29.696 ku,由4 207个原子组成,理论等电点为6.23。使用Prot Scale分析该蛋白疏水性平均值为-0.126,说明2-Cys Prx为亲水性蛋白。TMHMM对跨膜结构进行预测,发现,2-Cys Prx氨基酸序列中不存在跨膜结构域,为膜外蛋白。此外,对该蛋白二级结构进行预测,发现2-Cys Prx有4个α螺旋结构、9个β折叠结构及无规则卷曲构成。系统进化树分析表明,肥城桃果实2-Cys Prx与其他植物氨基酸序列有较高同源性,其中与樱桃的亲缘关系最近,相似度达到了98.15%,表明植物体内2-Cys Prx具有较高的保守性。体外构建重组蛋白p ET-30a-2-Cys Prx成功在大肠杆菌BL21中表达,为下一步研究其功能与结构,从而探讨2-Cys Prx基因调控桃果实氧化还原信号作用机理奠定了基础。

为了对羊口疮病毒(ORFV)安徽株121基因进行原核表达及生物信息学分析。以ORFV AH-F10株为模板对121基因进行PCR扩增,将扩增产物克隆至p GEX-6P-1原核表达载体,构建重组质粒p GEX-6P-1-121,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至E. coli Rosetta感受态细胞进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化,确定了ORFV 121重组蛋白表达的最佳条件。SDS-PAGE及Western-blot鉴定结果表明,重组蛋白大小约为60 ku,在Rosetta中高效表达,主要以包涵体形式存在且具有良好的反应原性。包涵体蛋白经过纯化后得到目的蛋白,将纯化蛋白与弗氏佐剂进行乳化后皮下注射6周龄的BALB/c雌鼠。每14 d后加强免疫1次,4次后收集小鼠血清。对收集到的血清进行Western-blot特异性鉴定,该抗体血清可以和阳性原核表达的ORFV 121蛋白进行特异性反应,表明成功制备鼠源多抗血清。利用生物信息学相关软件对目的基因编码蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点、二级结构和B细胞表位进行预测。结果显示该蛋白等电点为8. 86,属不稳定的亲水性蛋白;预测有50个可能的磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构域;二级结构中以无规则卷曲结构居多占62. 25%,α-螺旋、β-转角、延伸链分别占27. 81%,2. 98%,6. 95%;预测该蛋白存在8个潜在B细胞优势表位。成功表达了ORFV AH-F10 121蛋白并预测其生物学特性,为该蛋白结构与功能及ORFV致病机理的深入研究奠定基础。

为探究斑点叉尾鲖BPI1抗菌肽基因编码蛋白的结构特征,实验提取斑点叉尾鲖肾脏RNA,根据BPI1基因序列设计引物,利用PCR方法克隆BPI1基因并构建至原核表达载体p TWIN1中。构建成功的重组质粒p TWIN1-BPI1经原核表达,SDS-PAGE检测显示得到约为50 ku的融合蛋白,与预期结果相一致。通过生物信息学软件对BPI1基因编码的蛋白序列进行分析,结果显示,克隆所得斑点叉尾鲖BPI1基因编码一条由223个氨基酸残基组成的多肽,等电点为9.07,属于BPI超家族,是稳定的亲水蛋白。亚细胞定位B

为了深入研究己糖激酶(HK)的同工酶HKⅡ调控线粒体通透性转换孔(MPTP)的开放机理,通过RT-PCR技术和RACE技术,以克隆得到的肥城桃果实c DNA为模板,成功克隆得到HKⅡ基因全长,经原核表达和SDS-PAGE检测,体外构建原核表达载体pET-30a-HKⅡ,成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达;使用镍柱纯化法,得到纯化的重组蛋白。克隆得到HKⅡ基因共1 835 bp,其中编码区1 496 bp,共编码497个氨基酸。HKⅡ蛋白预测分子式为C2379H3846N652O717S17,原子

【目的】克隆马泰勒虫新疆株棒状体颈部蛋白4基因(RON4)并原核表达RON4蛋白。【方法】参考美国马泰勒虫WA株基因组数据及其他顶复门原虫RON4基因信息,设计特异性引物,以马泰勒虫新疆株DNA为模板克隆RON4基因片段,构建p ET-32a-RON4原核表达载体后进行原核表达与鉴定,并对RON4基因编码蛋白进行生物信息学分析。【结果】获得马泰勒虫新疆株RON4基因(NCBI登录号为:ON254212)。马泰勒虫新疆株与马泰勒虫WA株亲缘关系最近,RON4基因的核苷酸和氨基酸相似性分别为99.4%和99.0%;RON4基因在种间高度保守,其氨基酸序列与其他顶复门原虫具有高度相似的保守区域。成功构建了RON4蛋白原核表达载体,诱导表达获得分子质量为50 ku的重组包涵体蛋白;重组蛋白可与马泰勒虫阳性马血清特异性反应。生物信息学分析表明,马泰勒虫新疆株RON4蛋白的亲水性、柔韧性以及表面可及性较弱,B细胞表面抗原表位区域较少,形成表面抗原表位的结构基础条件不足。【结论】克隆获得了马泰勒虫新疆株RON4基因,并完成了原核表达及鉴定,该基因高度保守,在不同物种间可能具有相似的功能。

对溶藻弧菌外膜蛋白ＯｍｐＵ进行分子克隆构建，抗原性生物信息学分析，为疫苗的开发奠定了基础。通过分子克隆获得ＯｍｐＵ蛋白的原核表达菌株，重组表达后利用切胶纯化获得ＯｍｐＵ蛋白，免疫小鼠制备抗血清，Ｗｅｓｔｅｒｎ ＢｌＯｔｔｉｎｇ检测发现ＯｍｐＵ蛋白具有很好的抗原性。采用在线软件预测ＯｍｐＵ为亲水的分泌型蛋白；存在多个酶切位点。采用ｔｍＨｍｍ ｓｅｒｖｅｒ ｖ．２．０程序预测ＯｍｐＵ无跨膜结构并定位于细胞膜外。通过ｓｉｇｎａｌ ｐ ４．１软件分析发现ＯｍｐＵ的１～２１位氨基酸为信号肽序列。ｓＯｐｍａ服务器预测ＯｍｐＵ的二级结构含无规则卷曲２７．９４％，α－螺旋为３３．２４％，β－转角为１０．２９％．．．

为探究本实验室分离的传染性皮下及造血组织坏死病毒NJ株(IHHNV-NJ)ORF3基因编码蛋白的结构特征,本实验根据ORF3基因序列设计引物,利用PCR方法克隆ORF3基因序列,并构建至原核表达载体p ET-32a(+)中。对成功构建的p ET32a-ORF3重组表达载体进行原核表达,获得49 ku的融合蛋白,符合预期大小。通过生物信息学软件对ORF3基因编码蛋白序列进行分析,结果显示,ORF3基因序列长度为990 bp,编码329个氨基酸;ORF3基因编码蛋白理论分子质量为37 385.2 u,等电点为7.22,为亲水性蛋白;该编码蛋白序列不存在跨膜区、信号肽切割位点;二级结构含有55.9%...

为探讨斯氏副柔线虫免疫相关SHR基因作为疫苗候选抗原及早期诊断抗原的可能性,提取斯氏副柔线虫的总RNA,用RT-PCR技术扩增SHR基因,并将PCR产物克隆到pMD19-T载体,构建原核表达载体pET-30a(+)-SHR,利用在线软件对该基因编码蛋白序列进行生物信息学分析。结果表明:克隆获得SHR基因全长1 083 bp,编码360个氨基酸,理论等电点为6.09,无信号肽和跨膜区;磷酸化预测含有29个磷酸化位点;结构分析发现,α-螺旋构成二级结构的主要成分,亲水性氨基酸比例超过60%;抗原表位预测表明,SHR蛋白是一种抗原性较高的亲水性蛋白。推测SHR有望用作斯氏副柔线虫的免疫诊断抗原和疫苗候选抗原。

为探究捻转血矛线虫GST基因的原核表达及其生物信息学特征,以捻转血矛线虫cDNA为模板,设计特异性引物扩增GST基因,构建原核表达载体pET30a(+)-GST转化至E.coil BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌进行表达条件优化后,再通过SDS-PAGE分析蛋白表达的特征,并利用在线软件对GST蛋白进行生物信息学分析。结果表明:捻转血矛线虫GST基因大小为618 bp;诱导后的pET30a(+)-GST重组菌最佳诱导条件为0.05 mmol/L的IPTG在37℃时诱导6 h,以包涵体的形式存在,大小约为29 ku。生物信息学分析表明:GST分子式为C_(1083)H_(1657)N_(277)O_(294)S_6,属于不含信号肽和跨膜区的亲水性蛋白;二级结构主要由α螺旋形成;潜在的抗原表位主要位于25～48、55～63、92～106、113～124、139～147、170～189和195～205位氨基酸附近。本试验成功构建GST基因原核表达系统,优化表达条件下能稳定纯化GST重组蛋白,为进一步探索捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药机制及GST蛋白的生物学特性提供研究基础。

[目的]血管紧张素转换酶2(ACE2)是RAS系统的关键调控酶,在动物上的研究较少,本试验研究了山羊ACE2的相关理化性质和功能。[方法]利用同源克隆及RT-PCR技术,根据牛的ACE2基因mRNA序列设计引物,从山羊肾脏组织中扩增出ACE2基因编码区的特异性片段,TA克隆到p MD19-T载体并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,对生长出的单菌落进行验证后测序分析。根据测序分析结果设计引物,经PCR扩增和酶切连接,构建原核表达载体p ET-28a-ACE2,经过验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG诱导表达ACE2蛋白。[结果]山羊ACE2基因c DNA编码区共包括2 415个核苷酸...

为验证Lacc1基因的功能,揭示灵芝漆酶基因及其启动子结构与其转录表达的内在关系,预测了Lacc1的氨基酸序列结构及灵芝漆酶注释基因Lacc1的上游启动子区域,研究已测序的菌株——灵芝P9在Cu2+诱导条件下漆酶基因Lacc1的表达情况。Protein Blast分析结果表明,Lacc1含有3个铜氧化酶(Cu-oxidase)保守结构域,与Polyporus ciliatus漆酶lcc3-3的相似性最高,为71%,并具有高度保守的漆酶特征序列L1-L4;亚细胞位置和信号肽预测结果表明,Lacc1含有信号肽,且为胞外分泌酶;Lacc1基因上游启动子区域包含1个TATAbox、3个金属响应元件(M...

为研究玉米Ｚｍｃｅｎ基因的特征及生物学功能，并对其编码蛋白结构与功能进行分析。以玉米ｃ ＤｎＡ为模板，将其构建到带有ＧＳＴ表达标签的原核表达载体ｐ ＧｅＸ－６ｐ－１中，构建的重组载体ｐ ＧｅＸ－６ｐ－Ｚｍｃｅｎ转化至大肠杆菌ＢＬ２１（Ｄｅ３），通过０．３ ｍｍｏＬ／Ｌ ＩｐＴＧ在２７℃下诱导表达２０ ｈ，获得了可溶性的ＧＳＴ融合蛋白。采用ＧＳＴ亲和层析柱对重组蛋白进行纯化，经１２％ＳＤＳ－ｐＡＧｅ电泳和ＧＳＴ标签抗体ＷｅＳＴｅｒｎ ＢＬｏＴＴＩｎＧ检测，鉴定为含有ＧＳＴ－ＴＡＧ的融合蛋白，纯化的蛋白经ｐｒｅ ＳｃＩＳＳＩｏｎ ｐｒｏＴｅＡＳｅ（ｐｐＡＳｅ）过夜酶切切除ＧＳＴ标签，得到较纯的Ｚｍ．．．

旨在对合作猪StAR基因CDS区进行克隆及生物信息学分析，采用RT-qPCR方法检测StAR基因在不同组织中的表达量，以揭示其功能。结果发现，合作猪StAR基因CDS区长858 bp,编码285个氨基酸，与猪参考序列相比，第572位点处的A突变为G,导致第191位的赖氨酸突变成精氨酸，为错义突变，第791位点处插入1个碱基C,后续的20个氨基酸发生改变，导致移码突变；蛋白分子量90.95 ku,理论等电点8.87;消光系数33 835,不稳定系数41.49;含1个N-糖基化位点，二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲构成，二级结构与三级结构基本一致；合作猪与猪、绵羊和黄牛StAR基因核苷酸序列相似性分别为99.77%,90.45%,91.78%;进化树结果显示，合作猪与猪亲缘关系最近，表明StAR基因编码序列具有种属特异性；StAR蛋白是不稳定的亲水性蛋白，无信号肽和跨膜区；StAR基因在脾、肾、肺等组织中均有表达，睾丸表达量较高，表明可能与合作猪睾丸发育有关。