硫酸角质素具有丰富的携带大量负电荷的磺酸基团,参与生物矿化的成核过程。磺基转移酶催化磺酸基团的转移,对硫酸角质素的生物合成起决定性作用。本研究利用RACE技术克隆马氏珠母贝磺基转移酶PmCHST1a全长,并通过RNA干扰技术检测PmCHST1a对硫酸角质素合成及贝壳珍珠层形成的影响。结果显示,PmCHST1a基因全长1385 bp,编码366个氨基酸;含有磺基转移酶结构域,具有跨膜结构和信号肽,定位于高尔基体上。组织差异表达分析发现,PmCHST1a在中央膜显著高表达。注射PmCHST1a的RNAi探针后

为了探究肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)基因在马氏珠母贝中的免疫应答机制，本实验采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了马氏珠母贝TNFR27(PmTNFR27)基因cDNA全长并进行生物信息学分析，运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了马氏珠母贝在脂多糖(LPS)、聚肌胞苷酸(Poly (I:C))及镉胁迫后，PmTNFR27 mRNA在其不同组织的表达模式。结果显示，PmTNFR27 cDNA全长为1 524 bp，5′UTR长为186 bp，3′UTR长为248 bp，包含28 bp的poly(A)尾巴，开放阅读框(ORF)为1 062 bp，编码353个氨基酸；结构域预测表明PmTNFR27具有一个典型的CRD结构域和一个跨膜蛋白结构域，符合肿瘤坏死因子受体超家族特征；多序列比对结果显示，贝类种间的相似性不高，但功能结构域位置较保守。系统进化树结果显示马氏珠母贝与其他贝类聚为一簇。qRT-PCR结果显示，PmTNFR27 mRNA在马氏珠母贝各组织中均有表达，在鳃中相对表达量最高。LPS刺激后，PmTNFR27基因在鰓中的相对表达量于3 h显著上升并达到最高值，于72 h降到最低值，最高值约为最低值的9.67倍；Poly (I:C)刺激后，PmTNFR27基因在鰓中的相对表达量在6、12 h显著上升并达到最高值，至96 h时降到最低值，最高值约为最低值的13.16倍。镉胁迫后，3 h相对表达量达到最高，24、48 h相对表达量显著下降。研究结果表明PmTNFR27可能参与了马氏珠母贝的免疫应答反应。本研究可为进一步探究TNFR在贝类中的生物学功能提供重要的理论基础和参考价值。

L-氨基酸氧化酶（LAAO）是一种广泛存在于自然界中的免疫蛋白酶，为探究马氏珠母贝LAAO（Pinctada fucata martensii LAAO， PmLAAO）基因序列的特征及其在副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus， Vp）刺激后的表达变化，该研究克隆得到了PmLAAO的cDNA全长，其开放阅读框（ORF）长度为1767 bp，共编码588个氨基酸，具有FAD结合域和氨基酸氧化酶的结构域，是氨基酸氧化酶家族的一员。多序列比对结果和系统发育树显示，PmLAAO与双壳类动物的亲缘关系较近，其中，与加州贻贝LAAO具有的相似度最高。qRT-PCR结果显示PmLAAO在鳃、外套膜、闭壳肌、性腺、消化腺中均有表达，在鳃组织中表达水平最高；在Vp刺激后，PmLAAO在鳃组织中的表达水平显著升高，受刺激后48 h表达量最高。这些研究结果为新型免疫蛋白酶LAAO在双壳贝类中的功能活性提供了参考。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)是一种能够降解细胞外基质的蛋白水解酶。MMP-17是一种膜型基质金属蛋白酶,通过糖基磷脂酰肌醇连接于细胞表面,参与调控有机体的内环境稳定、宿主防御等多种生理过程。为研究MMP-17在马氏珠母贝免疫反应中的作用,实验运用RACE技术,克隆得到马氏珠母贝MMP-17(Pinctada martensii MMP,PmMMP-17)基因c DNA全长序列,并对其序列特征及功能进行初步分析。结果显示,Pm-MMP-17基因c DNA全长2 794 bp,开放阅读框(ORF)为1 923 bp,编码640个氨基酸,5'UTR长1...

(Fructose 1,6-bisphosphatase,FBP)是催化糖异生过程中的限速酶,当动植物体处于温度胁迫等不良环境条件时,FBP通过参与糖异生途径以维持机体的糖平衡,在动植物抗逆过程中起着重要作用。本实验通过RACE技术获得了马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)FBP(Pm-FBP)基因c DNA全长序列,并使用荧光定量PCR技术检测了该基因在马氏珠母贝不同组织的表达量,以及在17℃(低温组),22℃(对照组),32℃(高温组)条件下鳃中的时序表达模式。序列分析表明

Rab家族基因在囊泡的形成、转运、黏附、锚定和融合等各个阶段发挥重要作用。在已有的马氏珠母贝RabcDNA片段的基础上,采用RACE方法克隆了该基因的全长。cDNA长度2519bp,编码区长618bp,编码206个氨基酸。编码的蛋白质序列分析表明,该基因具有Rab家族的全部保守结构,与人类等其他生物的Rab7亚家族的同源性最高。RT-PCR结果显示,该基因在马氏珠母贝的鳃、足和胃组织中没有扩增产物,在卵、感染和未感染凿贝才女虫Polydora ciliata的马氏珠母贝的肝脏和血液中均检测到了与预期大小相符的扩增产物,存在组织差异性表达。

为了探究TLR6(Toll like receptor 6)在马氏珠母贝免疫反应中的作用,实验采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术获得了马氏珠母贝TLR6基因(Pm-TLR6)c DNA全长序列,并且运用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了Pm-TLR6在马氏珠母贝各组织中的表达情况、哈维氏弧菌刺激后和植核移植后血淋巴中的表达模式。结果显示:Pm-TLR6c DNA全长2295 bp,其中5′非编码区(UTR)长94 bp,3′UTR长89 bp,开放阅读框(ORF)长2112 bp,编

【目的】克隆苹果(Malus domestica Borkh.)异戊烯基转移酶(isopentenyltransferase,IPT)基因家族MdIPTs,分析MdIPT5a的生理功能,为深入研究MdIPTs在苹果细胞分裂素生物合成途径中的作用和基因的遗传转化提供理论依据。【方法】以‘富士’苹果为试材,利用RACE和苹果基因组信息克隆MdIPTs;利用洋葱表皮和拟南芥原生质体的瞬时表达研究MdIPT5a的亚细胞定位;通过农杆菌介导法遗传转化‘W38’烟草(Nicotiana tabacum cv.Wisconsin 38)过量表达MdIPT5a,RT-PCR鉴定转基因烟草。【结果】克隆了10个...

【目的】克隆小麦阿拉伯木聚糖阿魏酸酰基转移酶(arabinoxylan feruloyl transferase,AFT)基因,开发与FAX含量紧密连锁的功能标记,提高对FAX含量预测的准确性,为小麦加工品质的改良提供依据。【方法】应用FR846233为探针,通过同源克隆的方法获得小麦FAX含量基因gDNA全序列,使用DNAMAN软件比较高、低FAX含量品种间的序列差异性;基于序列差异使用Primer5.0软件设计特异性引物,开发与FAX含量紧密连锁的功能标记并利用一套中国春缺体-四体系和3AL、3AS双端体系进行染色体物理定位;同时结合PCR验证的方法,利用253份来自于中国主要冬麦区的小麦品种(系)对功能标记的实用性进行验证,采用IBM SPSS statistics 19.0软件进行FAX含量与基因型间的相关性分析等数据统计分析。【结果】2对特异性引物B1、B2最终扩增出长度分别为800 bp及710 bp的片段,B1和B2扩增的PCR片段有80 bp重叠,将片段拼接得到位于3A染色体上AFT基因TaBahd-A1。TaBahd-A1序列由1 429个碱基对组成,得到等位变异TaBahd-A1a和TaBahd-A1b,2个等位变异都拥有一个1 266 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),都具有2个外显子和1个内含子,内含子符合典型GT-AG结构,等位变异序列之间相似度为98.08%,具有24个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点和3个插入缺失(insertion-deletion,InDel)InDel位点,可编码421个氨基酸残基,预测分子量为45.2 kD。基于107 bp SNP处开发了2个互补显性标记AFTA2和AFTB2。AFTA2在TaBahd-A1a材料中能扩增出692 bp片段,与高FAX含量相关,在具有TaBahd-A1b等位变异的材料中未能扩增出片段。AFTB2则只能在TaBahd-A1b等位变异类型的材料中扩增出438 bp片段,并与低FAX含量相关,在TaBahd-A1a等位变异类型的材料中未能扩增出片段。同时利用一套中国春缺体-四体系和双端体材料将AFTA2和AFTB2定位在小麦3AL染色体。用功能标记AFTA2和AFTB2检测253份中国冬小麦材料,结果表明,不同基因型的FAX含量差异达到显著水平(P<0.05)。从不同麦区来看表现各有不同,其中在北部冬麦区不同基因型的FAX含量在北部冬麦区材料间差异不显著;而在黄淮麦区,含有TaBahd-A1a的品种FAX含量显著高于含有TaBahd-A1b的品种(P

【目的】克隆兔岩藻糖基转移酶(FUT2)基因,并进行原核表达,为进一步研究RHDV的感染过程和致病机理奠定物质基础。【方法】从兔肌肉组织中抽提基因组DNA作为模板,PCR扩增出FUT2基因,然后将该基因亚克隆入原核表达载体pET30a中,获得重组原核表达质粒pET30a-FUT2。将该重组原核表达质粒转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,分别用SDS-PAGE和Western-blot方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了FUT2基因,该基因长度为1 044bp。成功构建了原核重组表达质粒pET30a-FUT2,其诱导表达产物分子质量约为45ku;表达的重组...

为探讨桂花花瓣醇酰基转移酶基因的功能，从桂花品种‘柳叶金桂’花瓣中克隆得到１个醇酰基转移酶基因，命名为ＯｆＡＡＴ１，该基因全长１ ３８６ｂｐ，编码４６１个氨基酸；通过ｑＲＴ－ｐＣＲ分析发现，ＯｆＡＡＴ１基因在花器官尤其在花瓣中大量表达，而在幼叶中基本不表达；其表达量随着花朵的开放逐渐增加，至盛花期达到最大，末花期又减少；ＯｆＡＡＴ１基因的表达量在盛花期还呈现明显的昼升夜降的节律性变化；进一步的氨基酸序列比对和系统进化树分析表明，该基因编码的氨基酸存在酰基转移酶ｂＡＨＤ家族特有的保守结构域，与矮牵牛ｐＨＣｆＡＴ亲缘最近，其次是大豆ＧｍＣＨＡＴ和马铃薯ＳＴＣＨＡＴ；结合桂花花瓣香气挥发性成分分析，．．．

采用基于EST的电子克隆方法,以拟南芥(Arabidopsis thaliana)的尿黑酸叶绿基转移酶基因(Homogentisate phytyltransferase,HPT)cDNA序列为信息探针,对大豆的EST数据库进行同源检索筛选,获得了1 777 bp长大豆HPT基因的cDNA序列(GenBank登录号为:AY956421),经RT-PCR扩增、分子克隆和序列分析验证,表明与电子克隆序列一致;该基因具有完整的开放阅读框架(ORF,173～1 408 bp),推测编码411个氨基酸的蛋白。该蛋白与拟南芥(Ara-bidopsis thaliana)、苜蓿(Medicago sativ...

经PCR扩增得到虎纹蛙病毒DNA甲基转移酶完整基因片段 ,并将其克隆到pUCm -T载体 ,测序可知该基因读码框大小为 6 4 2bp ,编码一由 2 14个氨基酸组成的、预期分子量为 2 4 .8kD的多肽。RTV的MTase基因与蛙病毒属的蛙病毒 - 3型、叉尾病毒和Regina病毒的一致性为 96 %～ 97% ,与淋巴囊肿病毒属的比目鱼病毒的一致性为 5 6 % ,从而进一步证明RTV蛙病毒的分类地位 ;与其它脊椎动物的虹彩病毒一样 ,该基因包含原核生物 5’甲基转移酶的前四个高度保守区而缺少第五个区域 ,可能只是构成甲基转移酶的一个亚基 ;RTV、裂唇鱼病毒和大口黑鲈病毒之间MTa...

以6个中国梨品种为实验材料,对基因组DNA进行醇-酰基转移酶(AAT)基因的特异性PCR扩增、克隆、DNA序列测定和生物信息学分析,研究了中国梨AAT基因的遗传多态性。结果表明,浓香、微香、无香梨品种中均克隆到约1 600 bp大小的1-4条AAT基因。其中外显子部分存在1个HXXXD活性区和4个可变区,内含子中至少存在8处长度缺失和突变。基因结构分析表明,这些AAT基因同属于家族cl03601的转移酶基因家族pfam02548。系统发育分析表明,本实验所克隆到的中国梨AAT基因关系最近,与网上已知序列的苹果和西洋梨的关系略远。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该蛋白激酶通过磷酸化级联介导的信号通路在细胞对细胞外刺激的反应中起着重要作用。本研究利用cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术克隆获得马氏珠母贝MAPK p38(PmMAPK p38) cDNA 全长序列并对其序列进行生物信息学分析；利用实时荧光定量 PCR(qPCR)技术分析了PmMAKP p38在马氏珠母贝不同组织以及不同免疫刺激后的表达水平。结果显示，PmMAKP p38 cDNA全长为1 516 bp，开放阅读框长度为1 071 bp，共编码356个氨基酸，理论分子量为 40.88 ku；结构域预测结果表明PmMAPK p38含有MAPK家族典型的S＿TKc结构域；多序列比对、进化树构建以及MatGAT计算结果显示PmMAPK p38与其他物种的相似度、保守程度较高；荧光定量分析结果表明，该基因在马氏珠母贝中存在广泛表达，在肝胰腺中表达量最高，其次为外套膜，最低是闭壳肌。马氏珠母贝在受到LPS刺激后，PmMAKP p38的相对表达量在刺激后2 h达到最高，12 h降到最低，最高约为最低的5倍；而在哈维氏弧菌刺激后，PmMAKP p38的相对表达量在2 h达到最高，8 h降到最低，最高约为最低的4倍。研究表明，PmMAPK p38可能在马氏珠母贝的免疫反应，尤其是在抵御外部细菌侵入中起着重要的作用。本研究为贝类免疫防御系统的研究提供了基础资料。