［目的］研究马尾松紫色酸性磷酸酶基因功能及其对低磷胁迫的应答。［方法］采用ＲＡＣＥ法克隆马尾松紫色酸性磷酸酶（ＰＡＰｓ）家族成员Ｐｍ ＰＡＰ１，利用软件和数据库，对基因结构功能进行多重分析预测，检测其接种外生真菌及低磷胁迫下的表达模式。［结果］表明，Ｐｍ ＰＡＰ１基因Ｃ ＤＮＡ全长２ ５２０ ｂＰ，开放阅读框１ ８６９ ｂＰ，编码６２２个氨基酸残基，具紫色酸性磷酸酶保守结构域特征，属于高分子量ＰＡＰｓ。Ｐｍ ＰＡＰ１有信号肽，无跨膜区，推测定位于细胞质基质或细胞器基质中，它与莲（ＮＥｌｕｍｂｏ ＮｕＣｉｆＥＲＡ）、无油樟（ＡｍｂｏＲＥｌｌＡ ｔＲｉＣｈｏＰｏＤＡ）的亲缘关系最近，相似性分别达７．．．

通过对双角山羊草紫色酸性磷酸酶PAP1基因的核酸和氨基酸序列进行相关生物信息学分析,旨在进一步利用基因工程手段将Ae Bi PAP1基因转入到小麦中,为获得耐低磷胁迫能力增强的小麦品种提供种质基因。以双角山羊草叶片为材料,根据小麦中的PAP1基因和二穗短柄草的PAP1基因设计兼并引物,采用同源克隆的方法,获得了双角山羊草紫色酸性磷酸酶PAP1基因的c DNA序列,并将其命名为Ae Bi PAP1,该双角山羊草紫色酸性磷酸酶PAP1基因长1.124 kb,共编码335个氨基酸,相应的氨基酸分子量为38.131 k Da,等电点为5.77。与小麦中的PAP1基因相比,双角山羊草PAP1的c DNA...

【目的】克隆苹果紫色酸性磷酸酶相关基因MdPAP10,研究其组织表达模式和低磷响应,并进一步研究MdPAP10在低磷条件下的功能,为深入研究MdPAP10在果树中参与紫色酸性磷酸酶分泌和影响磷吸收的分子机理奠定基础。【方法】本研究以‘嘎啦’苹果(Malus×domestica‘Royal Gala’)为试材,利用同源序列比对和PCR技术,克隆苹果紫色酸性磷酸酶相关基因MdPAP10。通过NCBI分析MdPAP10的蛋白质结构并获得白梨、桃和草莓等10个物种的PAP10氨基酸序列,利用MEGA5.0构建系统

利用本实验室获得的杂色鲍(Haliotis diversicolor)转录组测序数据库,筛选出杂色鲍紫色酸性磷酸酯酶(Purple acid phosphatase,PAP)同源片段,进而克隆获得PAP的cDNA全序列,命名为HdPAP,并进行了HdPAP蛋白的结构分析和功能预测,同时利用实时定量PCR(qRT-PCR)技术分析HdPAP基因的组织表达谱和应激条件下的HdPAP表达变化。HdPAP基因cDNA全长1 215 bp,含有1个编码322个氨基酸的969 bp的开放阅读框。经Blast比对,与无脊椎动物半索动物门囊舌虫(Saccoglossus kowalevskii)的PAP氨基酸...

【目的】克隆GmPAP4启动子(PAP4-pro),并分析其表达特性,为进一步研究其作用机制奠定基础。【方法】依据GmPAP4 c DNA序列(Gen Bank No.HQ162477),通过比对大豆参考基因组,设计特异引物,克隆GmPAP4启动子序列,通过PLACE与Plant CARE在线生物信息学数据库预测该启动子相关调控元件。构建GmPAP4启动子驱动GUS表达载体(PAP4-pro-GUS)并转化根癌农杆菌GV3101;通过Floral dip法将PAP4-pro-GUS转化拟南芥,利用卡那霉素

克隆马尾松Ｐｉｎｕｓ ｍａｓｓｏｎｉａｎａ水通道蛋白（ａＱＰ），并对其生物信息学与干旱胁迫表达模式进行分析。采用逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）以及互补脱氧核糖核酸（Ｃ Ｄｎａ）末端快速扩增（ＲａＣＥ）方法克隆马尾松水通道蛋白基因。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Ｑ ＲＴ－ＰＣＲ）分析其在干旱胁迫下的响应模式。结果克隆到一个马尾松水通道蛋白基因，命名为Ｐｍ ＰｉＰ１（ＧＥｎ Ｂａｎｋ登录号为ｋＦ５８２０３８）。此基因Ｃ Ｄｎａ全长序列为１ ３０１ ＢＰ，包括８６７ ＢＰ的完整开放阅读框，９９ ＢＰ的５′末端非翻译区和３３５ ＢＰ的３′末端非翻译区。编码２８８个氨基酸残基，分子量为３０．８６．．．

设计3种磷水平的水培和土培试验,研究马尾松5个不同种源酸性磷酸酶(APase)活性和分泌性APase活性以进一步阐明造成马尾松不同种源对磷肥反应差异的适应机制及与磷效率等关系。结果表明,低磷胁迫会刺激马尾松根系APase向根际的分泌,其中福建武平和广东信宜种源根系分泌性APase活性较强,浙江淳安、江西崇义种源较低,仅为福建武平种源的5 0 %左右。在磷饥饿的诱导下,生长高峰期马尾松种源根系和针叶的APase活性显著提高,表现出与磷素水平的负相关,根系的APase活性在总体上高于针叶。统计分析发现,低磷水平下马尾松不同种源根系和针叶APase的活性存在显著的遗传差异,以福建武平和广东信宜2种源...

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是一种广泛分布的单脂磷酸水解酶,是动物生物代谢过程中重要的调控酶。实验首次克隆了大黄鱼ALP基因cDNA全序列,命名为LcALP,其全长为2 345 bp,开放阅读框为1 629 bp,编码543个氨基酸。实时荧光定量PCR检测发现,LcALP在大黄鱼雌雄各组织中均有表达,其中在眼和头肾的表达量最高,雌性鳃和脑中LcALP表达量显著高于雄性,而在性腺和脾脏中的表达量则显著低于雄性;胚胎发育过程中,多细胞期、囊胚期和原肠期LcALP基因表达水平相对较低,在卵黄栓形成期明显提高,至孵出期达到峰值,而初孵仔鱼期则显著下调;大黄鱼肌肉细胞系...

【目的】PIN1基因通过调控生长素极性运输的方式在植物根系生长发育中发挥作用。对马尾松PmPIN1基因进行全长克隆和功能分析,有助于在分子水平揭示马尾松的生根机制。【方法】运用PCR和RACE技术成功克隆马尾松PmPIN1基因cDNA序列;利用生物信息学软件分析PmPIN1基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列,并构建系统进化树;通过实时荧光定量分析PmPIN1基因在10年生马尾松幼根、1年生枝条、新叶、花中的表达量差异;利用农杆菌侵染法将PmPIN1基因转入烟草获得转基因植株,比较转基因烟草与转pCAMBIA-1302空白载体烟草之间的表型差异;用激光共聚焦显微镜观察PmPIN1-GFP荧光蛋白在转基因烟草根中的表达模式;酶联免疫法测定野生型和转基因烟草的根、根茎结合处及叶中的生长素含量;用不同浓度的生长素极性运输抑制剂1-N-萘基邻氨甲酰苯甲酸(NPA)处理野生型与转基因烟草,分析烟草根、根茎结合处、叶中的生长素含量变化;利用PEG介导法将16318-hGFP-PmPIN1重组载体转化至拟南芥原生质体中进行亚细胞定位分析。【结果】PmPIN1基因全长2914bp,包含2085bp的ORF,编码的蛋白由695个氨基酸组成,N端与C端均有膜运输蛋白。系统进化树显示马尾松与油松在发育树同一支上。通过实时荧光定量发现PmPIN1在不同组织中的表达量差异达到极显著,1年生枝条与幼根中表达量较高,花中最低。农杆菌介导法转化烟草获得的转基因烟草,较转空载烟草株高增长,生根量增加且根系变长。激光共聚焦显微镜观察得出转基因烟草根部中间有明显绿色荧光富集现象。酶联免疫法测定结果表明转基因烟草根、根茎结合处生长素含量高于野生型,且叶较根和根茎结合处减少。不同浓度NPA处理后,野生型烟草根中生长素含量变化达极显著,且生长素含量随NPA处理浓度的增加而减少;处理浓度为10nmol·L~(-1)时,叶中生长素含量最高;处理浓度为2nmol·L~(-1)时,根茎结合处生长素含量增加较多。不同浓度NPA处理后,转基因烟草不同部位生长素含量变化均未达到极显著。亚细胞定位分析表明PmPIN1蛋白主要分布于细胞膜上。【结论】马尾松PmPIN1与油松PIN1亲缘关系最近。PmPIN1属于膜蛋白。PmPIN1转基因烟草可能提高生长素由地上部位向地下部位的运输能力,减少NPA对生长素含量变化的影响,表明PmPIN1可能调控生长素的极性运输;PmPIN1-GFP绿色荧光富集在根部中间部位,PmPIN1在幼根中表达量较高,转基因烟草较转空载植株发根量多,根长长。研究结果表明PmPIN1基因可能在根系发育中发挥重要作用。

克隆获得马尾松Pinus massoniana PmGPX基因,进行生物信息学分析以及在不同抗虫材料表达模式分析。在前期马尾松转录组测序获得该基因片段基础上,用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得基因全长,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术分析该基因在不同抗虫材料中的表达模式。克隆获得基因cDNA全长序列,命名为PmGPX。该基因包含741 bp开放阅读框,编码246个氨基酸。序列分析表明:该基因具有GPX家族典型的保守结构域,等电点PI 8.29,蛋白分子量27.08 kDa,与针叶植

2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C-type protein phosphatases,PP2C)是ABA信号转导途径中的关键组分,在植物生长发育、细胞周期调节及应对逆境胁迫的过程中发挥重要的作用。为探究PP2C基因在烟草适应非生物胁迫中的功能,从烟草栽培品种K326中克隆到了一个PP2C同源基因,该基因开放阅读框为1 617 bp,编码538个氨基酸残基。同源性分析结果显示,该基因所编码的蛋白与绒毛状烟草PP2C16的亲缘关系最近,故命名为NtPP2C16。生物信息学分析表明,NtPP2C16催化

粟弯孢霉叶斑病为谷子重要的叶部病害,为了解钙调磷酸酶信号途径在粟弯孢霉叶斑病菌中的功能,对粟弯孢霉叶斑病菌钙调磷酸酶基因进行了克隆和初步分析。通过简并PCR法扩增获得了粟弯孢霉叶斑病菌钙调磷酸酶催化亚基ClCna和调节亚基ClCnb基因的同源片段,并利用RACE技术获得了ClCna和ClCnb基因序列同源片段的全长cDNA序列。粟弯孢霉叶斑病菌ClCna和ClCnb基因编码的蛋白与其他病原真菌钙调磷酸酶蛋白具有很高的同源性,ClCna基因编码的蛋白含有钙调素结合位点、钙调磷酸酶调节亚基结合位点和自身抑制调节位点,而ClCnb基因编码的蛋白含有4个钙离子结合位点。利用钙调磷酸酶特异性抑制剂环孢素...

松材线虫病是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)侵染引起的严重病害,引起重大的经济和生态损失。钙调素(CaM)是真核生物中Ca2+主要传导蛋白,本研究采用RT-PCR方法,首次从马尾松中克隆获得CaM,命名为pmCaM,并检测了其响应松材线虫侵染的表达特征。序列分析表明:pmCaM完整的开放阅读框核苷酸序列为450bp,编码149个氨基酸的蛋白质;该蛋白含有4个EF-hand结构域,具有钙调素的典型特征,与其它植物的CaM蛋白均有较高同源性。实时荧光定量PCR分析显示:接种松材线虫后30 180 min时间段,马尾松苗根、茎、叶器官中的pmCaM均下调表达,但不同...

为了研究甲羟戊酸-5-磷酸激酶(PMK)在紫苏萜类物质生物合成代谢通路中的重要作用，对紫苏转录组数据进行分析，挖掘出紫苏PMK基因参考序列，采用基因克隆技术从紫苏中克隆了PMK基因，利用生物信息学和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法对紫苏PMK基因进行了分析。结果表明，紫苏PMK基因开放阅读框(ORF)全长为1 524 bp,编码507个氨基酸。生物信息学分析显示，PfPMK的分子质量为54.73 ku,等电点为5.20,为亲水蛋白；紫苏PfPMK氨基酸与SmPMK、SsPMK、SbPMK和PvPMK同源性较高，说明紫苏PfPMK蛋白在进化过程中保守性较强。亲缘关系分析显示，PfPMK与丹参和一串红的PMK亲缘关系很近，在线软件WoLF-PSORT预测PfPMK蛋白可能定位于质膜或内质网膜上。qRT-PCR结果表明，PfPMK基因在紫苏根、茎、叶中均有表达，在根中的表达量高于在叶和茎中的表达量；紫苏不同生长发育时期的qRT-PCR分析显示，PfPMK基因在9月中下旬表达量较高。首次从紫苏中克隆出PfPMK基因，生物信息学分析该基因属于甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因，参与了紫苏萜类物质的生物合成。

6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)是植物海藻糖合成的关键酶,在植物逆境胁迫应答中发挥着重要的作用。实验以坛紫菜转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE技术克隆获得坛紫菜的3条TPS基因序列:Ph TPS1,Ph TPS2-1和Ph TPS2-2。序列分析结果表明,Ph TPS1(收录号:KM580358)序列全长3 557 bp,包含一个3 462 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含1 153个氨基酸,分子量为124.2 ku,等电点为6.73,属于TPSⅠ亚家族;Ph TPS2-1(收录号:KM519457)序列全长4 264 bp,包含一个4 044 bp的开放阅读框,所编码的多...