调查表明云南省昆明市团结乡香石竹普遍发生病毒病。电镜负染检测采自团结乡香石竹病毒病病样,病叶汁液中观察到弯曲长线型的病毒粒体,长度约1000~1600 nm,直径约12 nm。对这些病样的叶片进行间接ELISA检测,所有样品与香石竹坏死斑点病毒抗血清都呈阳性反应。按照报道的长线形病毒属简并引物合成引物,采用RT-PCR法对血清反应呈阳性的香石竹总RNA扩增了1059ntsHSP70基因部分编码序列,将其克隆到pMD18-T载体上,并进行序列分析。根据测序结果设计引物建立RT-PCR扩增检测方法并测定其灵敏度。结果表明,使用简并引物和新设计的引物均能从CNFV感病香石竹组织中扩增出与预期大小一致...

【目的】使用简并引物RT-PCR方法并结合序列测定与分析，为甲型香石竹斑驳病毒属（Alphacarmovirus）、乙型香石竹斑驳病毒属（Betacarmovirus）和丙型香石竹斑驳病毒属（Gammacarmovirus）病毒建立一种快速、灵敏、广谱的检测鉴定方法。【方法】通过基因组序列的多重比对分析，在依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRp）基因的保守区域设计1对简并引物Carmo-F2/Carmo-R2，在引物5′端分别加入非互补的富含AT序列（AATAAATCATAA）形成引物Carmo-F2a/Carmo-R2a，测试简并引物RT-PCR方法的广谱性、特异性和灵敏度，并对PCR产物进行测序、序列分析和系统发育分析。利用该方法对来自厦门的扶桑（Hibiscus rosa-sinensis）样品进行病毒检测。【结果】利用Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a两对引物建立的RT-PCR方法，扩增甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的部分RdRp基因，扩增片段分别约为500和550 bp。该方法成功用于检测甲型香石竹斑驳病毒属的香彩雀花碎色病毒（angelonia flower break virus,AnFBV）、小花矮牵牛斑驳病毒（calibrachoa mottle virus,CbMV）、香石竹斑驳病毒（carnation mottle virus,CarMV）、天竺葵花碎色病毒（pelargonium flower break virus,PFBV），乙型香石竹斑驳病毒属的木槿褪绿环斑病毒（hibiscus chlorotic ringspot virus,HCRSV），丙型香石竹斑驳病毒属的甜瓜坏死斑点病毒（melon necrotic spot virus,MNSV），显示出良好的广谱性。特异性检测表明，简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a在玉米褪绿斑驳病毒（maize chlorotic mottle virus,MCMV;Machlomovirus）、天竺葵线纹病毒（pelargonium line pattern virus,PLPV;Pelarspovirus）、香石竹环斑病毒（carnation ringspot virus,CRSV;Dianthovirus），健康的西瓜、甜瓜、南瓜、大豆、豌豆植物未扩增到预期大小的条带。灵敏度检测表明，简并引物Carmo-F2/Carmo-R2最低可检测到10-2稀释液，简并引物Carmo-F2a/Carmo-R2a可检测到10-3稀释液，在5′端加入非互补的富含AT序列可以提高简并引物RT-PCR检测方法的灵敏度。BLAST分析表明，测定的序列均与相应病毒种类具有最高序列一致性。部分RdRp基因氨基酸序列的系统发育分析结果符合目前通读病毒亚科（Procedovirinae）病毒的分类情况，且可以把病毒鉴定到种的水平。采集13份疑似病毒症状的扶桑样品，均检出木槿褪绿环斑病毒。【结论】基于简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a的RT-PCR方法，可用于甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的筛查检测，结合序列分析及系统发育分析可进行病毒种类的快速鉴定，并有助于发现新的病毒种类。厦门扶桑植物受到木槿褪绿环斑病毒的侵染。

利用非放射性标记物地高辛(DIG),通过PCR方法制备了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)DNA探针,探针长度705bp,标记产量为20ng/μL。通过核酸探针斑点杂交检测方法对此探针特异性及灵敏度进行验证,结果表明,该探针具有较高的灵敏度和较强的特异性,检测IHHNVDNA的检出灵敏度为24.8pg,可检出26.6ng患病对虾组织DNA中的IHHNV,与250.4ng健康虾组织DNA、202.5ng健康虾匀浆液,白斑综合症病毒(WSSV)DNA和肝胰腺细小病毒(HPV)DNA均不发生交叉反应。本方法可应用于健康亲虾、苗种的培育和无特定病原(SPF)对虾种群的选育及IHHNV流行病...

根据凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot tospovirus,INSV)S RNA上的核衣壳蛋白(N)基因序列(登录号为AB109100)保守区设计了3对特异性引物。应用常规RT-PCR和巢式PCR方法从表现同心圆症状的文心兰植株上检测得到了预期DNA片段,且巢式PCR检测灵敏度比常规PCR高。序列分析结果表明,该病毒的N基因序列和已经发表的凤仙花坏死斑病毒(登录号为AB109100、AB207803、DQ425096)核苷酸序列同源性为99%,确定表现同心圆症状的文心兰上携带了凤仙花坏死斑病毒。

根据GenBank中登录的鱼类神经坏死病毒CP基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光RT-PCR反应条件进行优化,建立了用于检测鱼类神经坏死病毒的实时荧光RT-PCR方法。利用该方法检测鱼类神经坏死病毒及其他多种常见的水生动物RNA病毒,结果只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.2pg/μL的总RNA。与RT-PCR的灵敏度对比试验表明,其敏感度比RT-PCR高100倍。对同一样品进行检测,在组内及组间的变异系数分别为0.9%以及1.5%,证实其重复性极好,并且从抽提核酸到得出结果仅需4h。对临床500份样品进行鱼类神...

【目的】建立鳜弹状病毒(SCRV)和传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的双重PCR检测方法。【方法】分别针对SCRV N基因和ISKNV MCP基因的保守区域设计特异性引物,通过优化退火温度和引物用量(μL)比,建立SCRV和ISKNV的双重PCR检测方法,并对该方法的敏感性和特异性进行检验。应用建立的双重PCR方法对20份临床样品进行单一和双重PCR检测,比较单一和双重PCR的检测结果。【结果】成功建立了SCRV和ISKNV双重PCR方法,该法特异性较强,对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、神经坏死病毒(NNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)等鱼类常见病毒无扩增;敏感性较好,对2种病毒DNA的检测下限均为0.01 ng/μL。20份临床样品的双重PCR样品检测结果显示,3份为SCRV阳性,11份为ISKNV阳性,2份为SCRV和ISKNV混合感染,结果与单一PCR检测结果一致。【结论】建立的SCRV和ISKNV双重PCR检测方法特异性较强,敏感性较好,可用于鳜鱼SCRV与ISKNV的快速鉴别诊断和分子流行病学调查。

为更好地实现对养殖海区栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)的快速诊断和分子流行病学的调查,以及AVNV的疫情监测,选择AVNV全基因组序列中的保守区段,应用Accelrys gene 2.5软件设计一对巢式引物,用于AVNV的检测。结果显示,引物的扩增片段分别为979和548 bp。实验优化了PCR体系中Mg2+和dNTPs浓度及扩增程序中的退火温度,并建立了完善的AVNV巢式PCR检测技术。研究表明,该PCR检测技术具有较高的敏感性,可稳定检测出5 pg扇贝样品组织总核酸中5×10 copies的病毒粒子。

神经坏死病毒(Nervousnecrosisvirus)是导致多种海水鱼类神经性病害的致病原。发病及死亡的石斑鱼除了表现神经异常症状外,无明显的临床病症,体表及内脏组织也未发现明显病变及寄生虫感染。2003年4～8月,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从福建南部人工养殖的5种石斑鱼即紫石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)、马拉巴石斑鱼(E.malabaricus)、青石斑鱼(E.awoara)、赤点石斑鱼(E.akaara)和云纹石斑鱼(E.moara)中检出5个神经坏死病毒分离株。检测了76份石斑鱼样品,这些石斑鱼NNV病毒的平均感染率约为90%。对这些病毒的RT...

针对斑点叉尾鮰疱疹病毒(CCV)的ORF6基因设计引物和探针,PCR产物在扩增过程中标记地高辛,探针5′端用生物素标记,建立了CCV的敏感、快速、环保的PCR-ELISA检测方法。对反应条件进行了优化,并评估了该方法的特异性和敏感性。结果表明:该方法可特异性检测CCV DNA,与各对照均无交叉反应,具有高度特异性;该方法对CCV DNA的检测阈值为5 fg,敏感性是常规PCR检测方法的10倍。用此方法对人工感染样品进行检测,能够检测到感染组织中的CCV DNA。该方法能够定性和半定量检测CCV DNA,可用于斑点叉尾鮰疱疹病毒的检测、斑点叉尾鮰暴发性流行病的诊断。

实验建立了一套反转录环介导等温扩增方法(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP),用于实验室及现场检测鲑鳟鱼传染性造血器官坏死病毒(infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)。针对IHNV的核蛋白基因设计特异性引物,以IHNV基因组RNA为模板,在反转录酶及Bst DNA聚合酶的作用下进行反转录LAMP,结果阳性样本表现为荧光绿色,阴性样本仍为红棕色。反应条件优化结果表明最适反应温度为64℃;特异性试验表明仅IHNV发生特异性扩增,而SVCV、HRV、VHSV和H_2O均不发生反应;敏感性试验表明该LAMP方法可检出浓度为1.0×10~(-4)μg/μL的IHNV核酸。本研究所建立的IHNV反转录LAMP检测法成本低、操作简单、反应迅速、不依赖专门的仪器,同时具有较高的灵敏度和特异性,适合IHNV的现场检测和大批量样品的检疫。

为选择较为适合甜菜总RNA的提取方法,构建和优化RT有效体系。以田间甜菜叶片、根毛及根表皮为材料,研究了提取甜菜总RNA的方法以及利用RT-PCR技术进行甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)的检测。研究表明,获得良好的RT-PCR扩增效果,RT体系中dNTPs浓度、引物、AMV、模板RNA的浓度要分别达到1 mmol/L,1μmol/L,0.1 U/μL,0.01μg/μL较好。PCR体系中dNTPs浓度、引物、TaqDNA聚合酶、Mg2+的浓度要分别达到0.1 mmol/L,0.1μmol/L,0.01U/μL,1.48 mmol/L效果较好。RT-PCR法对BNYVV检测,可作为甜菜品种(育种材...

以纯化的兔抗传染性胰坏死病病毒(IPNV)VP2重组蛋白多克隆抗体为包被抗体,抗IPNV VP2单克隆抗体为检测抗体建立了IPNV双抗体夹心ELISA方法。优化反应条件为:兔抗IPNV VP2重组蛋白多克隆抗体包被浓度为1.28μg/mL,抗IPNV VP2单克隆抗体的工作浓度为1.34μg/mL,酶标二抗稀释比例为1∶2 000,以P/N>2,且OD490 nm>0.101 494作为阳性判定标准。该方法的重复性变异系数均小于10%,与传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、轮状病毒(HRV)无交叉反应。对41份虹鳟肝脏样品分别进行...

针对传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的ORF007基因,设计特异性引物及TaqMan探针,建立了ISKNV的实时荧光定量PCR方法。采用CPE法对连续10倍稀释的ISKNV培养液的滴度进行了测定,同时采用荧光定量PCR法测定病毒拷贝数。结果显示,荧光定量PCR测定的病毒拷贝数与CPE法测定的病毒滴度具有良好的线性关系,其线性方程为y=1.076x+0.545(R2=0.998 6),其中y为基因组拷贝数浓度的对数,x为病毒滴度TCID50的对数。研究表明,荧光定量PCR法可替代CPE法应用于ISKNV疫苗抗原的定量,大大缩短了疫苗制备的时间,为疫苗生产提供了方便。

将逆转录环介导的等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)引入到鱼类的传染性造血器官坏死病病毒(infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)检测中,建立了简单、快速、灵敏的IHNV检测方法。针对IHNV的聚合酶蛋白基因(polymerase protein,L)设计特异性引物,以IHNV基因组RNA为模板,在反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下进行RT-LAMP,反应产物添加SYBR Green I荧光染料后,肉眼观察阳性样本表现为荧光...

对虾传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)可感染世界各地养殖对虾,给对虾养殖业造成严重经济损失。本实验首次采用实时定量PCR法对广西地区的84份凡纳滨对虾样品进行检测,同时以常规PCR检测作对照。实时定量PCR检测阳性率为79·8%,常规PCR检测阳性率为40·5%,表明广西地区养殖的凡纳滨对虾IHHNV的感染率较高。将二者检测均呈阳性的30份样品扩增产物进行序列分析测序,测序结果通过DNA STAR软件包进行分析,并通过NCBI Blast与GenBank中的序列进行比对。结果证明,测定的是IHHNV序列。30份样品的IHHNV序列很保守,可以分为4种类型,仅有两个碱基的位置发生变异。实...