【目的】LmKnickkopf3-5′(LmKnk3-5′)是飞蝗(Locusta migratoria)蜕皮发育中重要的表皮蛋白。本文旨在制备LmKnk3-5′特异抗体并对其进行组织定位,为LmKnk3-5′生物学功能研究提供蛋白水平的证据,同时为进一步深入探究LmKnk3-5′与其他表皮蛋白在飞蝗表皮形成过程中的协同作用打下基础。【方法】首先比对飞蝗Knickkopf(Knk)家族4个基因LmKnk、LmKnk2、LmKnk3-FL和LmKnk3-5′的氨基酸序列,选取LmKnk3-5′的3段特异抗原序列R1、R2和R3,设计包含Bam H I、Hind III酶切位点的引物,以LmKnk3-5′全长cDNA为模板,PCR获得LmKnk3-5′的特异抗原片段;然后将特异抗原片段与pET-32a经双酶切、T4连接酶连接、测序验证、成功构建重组质粒后,转入BL21(DE3)表达菌株中,加入IPTG(终浓度0.5 mmol·L-1)低温(16℃)诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况;接着扩大培养可在菌体裂解液的上清中表达重组融合蛋白的大肠杆菌,提取蛋白并用Ni-NTA对其进行纯化,之后再用纯化后的重组特异抗原免疫小鼠4次,获得anti-LmKnk3-5′多克隆抗体,ELISA法对其进行效价检测,并用Western blot法检测其特异性。取飞蝗5龄若虫第8天表皮,制备石蜡切片,通过免疫组化法对LmKnk3-5′蛋白进行组织定位。【结果】通过氨基酸序列比对,选取LmKnk3-5′的特异抗原区域R1、R2和R3,分别包含208、147和131个氨基酸残基,蛋白理论分子量分别为24.0、17.0和14.8 kD。酶切连接后,成功获得pET-32a-R1、pET-32a-R2和pET-32a-R3重组质粒。诱导表达检测,发现只有含pET-32a-R2的表达菌在菌体裂解液的上清液中大量表达重组蛋白。将其扩大培养纯化后获得R2重组融合蛋白,免疫小鼠取抗血清进行效价检测,抗体效价高达1﹕512 000,可满足抗体使用需求。Western blot结果表明,注射ds LmKnk3-5′后飞蝗体壁LmKnk3-5′的蛋白表达显著减少,表明anti-LmKnk3-5′抗体特异性良好。免疫组化试验结果表明,表皮蛋白LmKnk3-5′在飞蝗腹部体壁皮细胞及新表皮中均有分布,特别是新合成的外表皮顶端。【结论】成功获得飞蝗LmKnk3-5′多克隆抗体,证明其特异性良好。LmKnk3-5′在飞蝗腹部体壁新合成的外表皮顶端分布较多。研究结果为飞蝗表皮蛋白LmKnk3-5′功能研究提供了蛋白水平的证据。

【目的】基于飞蝗(Locusta migratoria)转录组数据库获得内表皮蛋白(endocuticle structural glycoprotein)基因Lm Abd-5的c DNA序列,分析该基因的序列特征和m RNA表达特性,采用RNAi方法分析其生物学功能,探讨其在飞蝗表皮形成中的作用,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库,获得Lm Abd-5 c DNA全长序列并克隆验证;采用Signal P在线软件分析蛋白的信号肽,利用SMART网站预测其功能域,使用

【目的】探讨家蚕(Bombyx mori)表皮蛋白BmCPAP3-G的表达特征及与几丁质的结合方式,为家蚕表皮蛋白的功能研究提供依据。【方法】应用生物信息学方法分析家蚕CPAP家族表皮蛋白及BmCPAP3-G的结构域的序列特征;利用原核表达的方法表达BmCPAP3-G的融合蛋白,通过镍柱亲和层析技术纯化可溶性蛋白,利用5800 MALDI-TOF/TOF质谱鉴定正确后进行多克隆抗体制备,并利用几丁质亲和层析技术验证BmCPAP3-G与几丁质的结合;利用半定量RT-PCR和Western blot方法对Bm

豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）是苜蓿田的重要害虫，严重影响苜蓿的产量和品质。为解析豌豆蚜适应苜蓿的分子机制，本研究检测豌豆蚜取食“猎人河”（感蚜）和“甘农5号”（抗蚜）2个苜蓿品种后6个表皮蛋白基因（ApCP7、ApCP10、ApCP19、ApCP35、ApCP62和ApCP19.8-like）的表达水平，并检测了沉默了2个表皮蛋白基因（ApCP7和ApCP62）的豌豆蚜在“猎人河”苜蓿上的存活率。结果表明，与取食“猎人河”苜蓿相比，取食“甘农5号”苜蓿后，豌豆蚜6个表皮蛋白基因的表达水平在头部中显著下调（P<0.01），而在卵巢显著上调（P<0.01）。在腹部组织中，除表皮蛋白ApCP7基因显著上调（P<0.01）外，其余表达水平均显著下调（P<0.01）；ApCP7、ApCP19、ApCP19.8-like和ApCP62在表皮组织中显著上调（P<0.05）。沉默表皮蛋白基因ApCP7和ApCP62后，豌豆蚜取食“猎人河”苜蓿72h后的存活率均显著降低（P＜0.05），分别为76.67%±0.37%和80.67%±0.58%。据此推测，ApCP7和ApCP62可能在豌豆蚜适应不同抗性水平的苜蓿品种中发挥作用，结果可为解析豌豆蚜与苜蓿的互作关系提供理论依据。

【目的】作为昆虫表皮重要的结构物质，表皮蛋白（cuticle protein,CP）在昆虫对农药表皮穿透抗性形成过程中承担重要作用。锈赤扁谷盗（Cryptolestes ferrugineus）磷化氢抗性问题日益突出，论文旨在揭示表皮蛋白基因在该害虫磷化氢抗性形成过程中的作用。【方法】基于联合国粮农组织（FAO）推荐的生物测定方法解析5个地理种群（张家港、湘阴、淮安、怀化和太仓种群)锈赤扁谷盗磷化氢敏感性差异。首先通过锈赤扁谷盗转录组数据鉴定获得4个表皮蛋白基因，进而构建系统发育树，并对相应氨基酸序列进行分析。利用基因定量技术（RT-qPCR）解析上述4个锈赤扁谷盗表皮蛋白基因时空（不同发育阶段和成虫不同组织）和不同磷化氢抗性水平下的表达模式，以及表皮蛋白基因对磷化氢胁迫响应的表达模式。使用RNAi(RNA interference)技术对特定的表皮蛋白基因（CfRR2-1）进行沉默，并研究CfRR2-1被有效沉默后锈赤扁谷盗磷化氢敏感性变化情况。【结果】磷化氢敏感性测定结果显示，不同地理种群锈赤扁谷盗磷化氢敏感性水平差异显著，药剂抗性倍数（RR）范围为7.2—1 906.8。系统发育分析显示锈赤扁谷盗4个表皮蛋白均隶属于CPR家族RR2亚家族，且它们氨基酸序列都拥有RR2型几丁质结合域，将其分别命名为CfRR2-1、CfRR2-2、CfRR2-3和CfRR2-4。基因表达模式分析显示4个表皮蛋白基因均在锈赤扁谷盗蛹期特异性高表达，且在成虫外周组织中表达水平较高；此外，表皮蛋白基因均在磷化氢极高抗种群中（太仓种群，RR=1 906.8）显著高表达，且锈赤扁谷盗经磷化氢熏蒸胁迫后，表皮蛋白基因可被显著诱导表达。最后，选择CfRR2-1进行功能验证，注射dsRNA干扰极高抗种群（TC）CfRR2-1的表达后，导致锈赤扁谷盗对磷化氢抗性水平显著降低。【结论】表皮蛋白基因过表达参与锈赤扁谷盗磷化氢抗性形成。

【目的】表皮蛋白是昆虫表皮重要的结构物质，大量研究已经证实表皮蛋白基因参与介导昆虫抗药性形成。以赤拟谷盗（Tribolium castaneum）为研究对象，解析表皮蛋白基因TcCP14.6(cuticle protein CP14.6)和TcLCPA3A(larval cuticle protein A3A)在昆虫磷化氢抗性形成过程中的作用。【方法】采用联合国粮农组织（FAO）推荐的磷化氢熏蒸方法对采自5个省份赤拟谷盗的磷化氢抗性水平进行测定。基于赤拟谷盗基因组数据获得TcCP14.6和TcLCPA3A的cDNA序列，利用在线生物信息学分析软件预测其编码的氨基酸序列、信号肽和保守结构域。分别提取赤拟谷盗不同组织（头、胸、腹的表皮、翅、足、肠道、马氏管和脂肪体）、不同磷化氢抗性水平以及磷化氢胁迫后试虫的总RNA。以TcRPS和TcRPL为内参基因，运用RT-qPCR技术分析TcCP14.6和TcLCPA3A在赤拟谷盗不同组织、不同磷化氢抗性水平和药剂胁迫下的表达模式。最后，通过RNA干扰技术结合生物测定方法分析TcCP14.6和TcLCPA3A与赤拟谷盗磷化氢抗性的关系。【结果】生物测定结果表明，江苏（JS,RR=1.7）和云南（YN,RR=3.0）种群对磷化氢保持敏感，湖南种群（HN,RR=20.2）表现为中等抗性，四川（SC,RR=395.4）和广东（GD, RR=862.7）种群表现为极高抗。序列分析结果表明TcCP14.6和TcLCPA3A蛋白均包含信号肽和保守的几丁质结合域。RT-qPCR结果显示，TcCP14.6和TcLCPA3A均在赤拟谷盗表皮组织中高表达，而在内部器官（脂肪体、肠道、马氏管）中的表达量相对较低。此外，TcCP14.6表达量随磷化氢抗性水平的增加呈上调趋势，而TcLCPA3A表达量则呈下降趋势；赤拟谷盗经磷化氢熏蒸处理6 h,TcCP14.6和TcLCPA3A的表达量分别呈现上调和下调趋势。注射dsRNA分别干扰抗性（GD）和敏感（YN）种群两个基因的表达后再用LC30的磷化氢浓度处理试虫。与对照相比，TcCP14.6基因沉默后赤拟谷盗的死亡率显著升高，而TcLCPA3A基因沉默后试虫死亡率显著下降。【结论】表皮蛋白基因TcCP14.6和TcLCPA3A参与介导赤拟谷盗对磷化氢的抗性。

【目的】双链RNA降解酶(dsRNA degrading enzyme, dsRNase)是制约RNA干扰(RNAi)技术在害虫防治中应用的关键因素之一。本研究旨在利用原核表达系统获得飞蝗LmdsRNase2和LmdsRNase3的特异抗原,进而制备抗体,对其进行组织定位和蛋白表达量检测,为进一步解析飞蝗中肠dsRNA降解酶基因的功能分化提供蛋白水平的证据。【方法】通过对LmdsRNase2和LmdsRNase3的氨基酸序列(GenBank:ARW74135.1和ARW74134.1)进行比对,分别选取特异的LmdsRNase2和LmdsRNase3抗原序列(R2’、R3’)进行后续的研究。根据LmdsRNase2和LmdsRNase3的cDNA全长序列,设计包含酶切位点BamH I、Hind Ⅲ的引物,采用PCR技术扩增目标片段,双酶切后连接至pET-32a载体。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,加入IPTG至终浓度为0.5mmol·L~(-1),37℃下诱导4 h后提取蛋白,采用SDS-PAGE电泳方法检测蛋白表达。大量培养带重组质粒的大肠杆菌,诱导目的蛋白大量表达,用镍柱亲和层析法分离R2’和R3’蛋白,Bradford法检测蛋白浓度。经两次免疫新西兰大白兔后,最终获得LmdsRNase2和LmdsRNase3的多克隆抗体。利用ELISA法测定多克隆抗体的效价,通过Western blot检测抗体的特异性。提取飞蝗5龄第3天的中肠组织蛋白和中肠液,分别用LmdsRNase2和LmdsRNase3的抗体检测其表达量。最后制备飞蝗5龄第3天的中肠石蜡切片,通过免疫组化对LmdsRNase2和LmdsRNase3蛋白进行亚细胞定位。【结果】通过氨基酸序列比对发现,LmdsRNase2和LmdsRNase3具有37%的序列一致度,选取特异的序列R2’和R3’设计引物,分别包含157和153个氨基酸残基,理论分子量分别为17.0和16.8 kD。在IPTG浓度为0.5 mmol·L~(-1)条件下,37℃诱导4 h后,目的蛋白在包涵体中大量表达。扩大培养重组菌株后提取蛋白,用镍亲和层析柱分离得到纯度为85%的R2’蛋白,可直接用于免疫;而R3’蛋白的纯度低于85%,利用电泳切胶纯化后免疫新西兰大白兔,36 d后取抗血清进行检测,效价均达到1:102 400,表明抗体效果良好。用多克隆抗体杂交实验室保存的His-LmdsRNase2和His-LmdsRNase3融合蛋白,对抗体进行特异性检测,结果表明R2和R3的抗体分别特异性识别LmdsRNase2和LmdsRNase3,无交叉杂交现象,且条带与His抗体杂交到的条带大小一致。采用Western blot方法检测,发现LmdsRNase2蛋白在中肠组织中高表达,但在中肠液中未检测到可见表达,LmdsRNase3蛋白在中肠组织和中肠液中均未检测到表达。进一步采用免疫组化方法对两个蛋白进行组织定位,发现LmdsRNase2和LmdsRNase3均在中肠细胞质中表达,但LmdsRNae3的表达量较低。【结论】成功制备了特异性良好的飞蝗LmdsRNase2和LmdsRNase3抗体,Western blot和免疫组化分析表明LmdsRNase2在中肠细胞质中高表达,而LmdsRNase3的表达量很低。研究结果为飞蝗中肠两个dsRNA降解酶LmdsRNase2和LmdsRNase3的功能分化提供了蛋白水平的证据。

为构建小鼠BMP3蛋白原核表达载体,纯化BMP3蛋白,制备并鉴定BMP3蛋白小鼠多克隆抗体,以及对BMP3进行系统进化关系研究。采用RT-PCR方法从小鼠肝脏中克隆获得BMP3蛋白的表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得BMP3蛋白,免疫小鼠制备BMP3蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度达1∶3 200倍,Western Blotting证实抗血清具有很好的特异性。通过DNAMAN软件对BMP3序列同源性分析发现其C-端在不同动物间存在较高同源性;MEGA软件对BMP3序列的系统发生分析证实BMP3在动物间具有明显的进化趋势。为BMP3蛋白调控骨代谢及与肿瘤的关...

近年来罗非鱼湖病毒(TiLV)在多个国家流行,对世界罗非鱼养殖业造成严重威胁。中国是罗非鱼第一养殖大国,尽管我国大陆还没有TiLV的正式报道,鉴于吉富罗非鱼是我国重要的罗非鱼养殖品种,其对TiLV的感染特性研究具有重要意义。本实验采用TiLV对吉富罗非鱼进行人工感染,随后在肝脏组织中克隆和测定了TiLV第6片段基因。罗非鱼湖病毒第6片段基因cDNA全长1 044 bp,开放读码框(ORF)为954 bp,编码317个氨基酸,预测分子量为36.38 ku;5′非编码区(NCR)为19 bp,3′非编码区(NCR)为972 bp。系统进化树分析表明该蛋白属于TiLV核蛋白(NP)。随后在大肠杆菌中表达和提纯了GST融合NP蛋白,在新西兰大白兔上制备了多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体效价为1∶51 200,且抗体可特异性识别感染组织中的病毒NP蛋白。对吉富罗非鱼不同组织进行苏木精—伊红(H.E)染色观察,发现肝脏组织坏死并形成合胞体,脾脏部分细胞出现空泡、坏死,含铁血黄素增多,头肾细胞坏死,鳃丝上皮细胞明显解离脱落,鳃小片黏连,脑组织细胞肿大。通过蛋白印迹法(WB)和免疫组化(IHC)对人工感染TiLV的吉富罗非鱼不同组织进行检测,结果显示,NP蛋白在肝脏、脑、体肾和头肾等组织中均有表达,以肝脏组织中表达量最高。为了解吉富罗非鱼对TiLV的免疫反应,通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)测定免疫因子TNF-α和TGF-β在主要免疫器官脾脏和头肾组织中的表达。研究表明,在感染早期(感染后12～24 h),病毒可显著抑制TNF-α和TGF-β在脾脏和头肾中的表达,可能通过抑制宿主这些免疫因子来促进病毒自身早期的复制。本研究将为进一步解读TiLV的致病机理及其高效防控提供理论基础。

为探讨干扰素3(Interferon 3,IFN3)在抗病毒免疫应答中的作用,以草鱼(Ctenopharyngodon idella)巨噬细胞cDNA为模板,PCR扩增IFN3成熟肽基因序列,制备草鱼IFN3蛋白的多克隆抗体,同时研究了IFN3在草鱼不同免疫组织中的蛋白表达,以及草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)感染草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)后不同时间点的表达。结果显示,细菌表达的重组IFN3大小约为45 kD,主要以包涵体形式存在;抗体效价约为1∶3 200,制备的多克隆抗体既能识别原核表达的重组蛋白,也能识别个体水平上和细胞水平上的内源蛋白。草鱼主要免疫组织中,肝胰腺和皮肤检测到相应条带。CIK细胞感染病毒后12 h开始检测到IFN3蛋白,随感染时间的延长,IFN3蛋白表达量有所增加。蛋白水平上检测IFN3的表达,为深入研究草鱼的抗病毒免疫机制奠定了基础。

【目的】通过制备飞蝗(Locusta migratoria)几丁质酶5-1(LmCht5-1)的多克隆抗体,建立飞蝗体内LmCht5-1蛋白水平检测方法,分析LmCht5-1在4龄飞蝗的表达特性及组织定位。【方法】采用MEGA软件对LmCht5-1和LmCht5-2氨基酸序列进行比对,利用Expression网站对LmCht5-1氨基酸序列进行抗原表位预测分析,获得LmCht5-1抗原结构区域;以飞蝗c DNA为模板,通过PCR扩增LmCht5-1的抗原片段;同时通过酶切连接构建含有鸡血清白蛋白OVA的载体p ET32a-OVA;然后通过酶切连接将LmCht5-1插入到p ET32a-OVA载体构建p ET32a-OVA-LmCht5-1;将p ET32a-OVA-LmCht5-1转入表达菌株BL21(DE3)中,IPTG诱导表达重组蛋白OVA-LmCht5-1;利用Ni-NTA纯化后免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。通过ELISA方法检测抗体效价;利用Western blot检测抗体特异性。提取4龄飞蝗不同日龄表皮,采用Western blot分析LmCht5-1蛋白表达模式。对4龄飞蝗注射ds LmCht5-1,检测蛋白水平LmCht5-1表达量,并通过免疫组化方法对LmCht5-1进行定位及功能分析。【结果】通过LmCht5-1和LmCht5-2序列比对和抗原表位预测分析,获得LmCht5-1的471—533AA可作为抗原区域;通过酶切连接分别获得p ET32a-OVA和p ET32a-OVA-LmCht5-1。经诱导表达和纯化后获得重组蛋白OVA-LmCht5-1,分子量为71.34 k D;免疫后制备多克隆抗体OVA-LmCht5-1,ELISA检测效价为1﹕102 400。多克隆抗体OVA-LmCht5-1用于Western blot检测时可特异性识别LmCht5-1,与LmCht5-2蛋白无交叉反应。利用Western blot方法检测4龄若虫各日龄表皮中LmCht5-1蛋白的表达,发现LmCht5-1蛋白随发育日龄其表达量逐渐增加,在蜕皮当天达到峰值,蜕皮后快速降至最低点。对飞蝗若虫N4D2注射ds LmCht5-1,检测到在N4D5时,LmCht5-1的转录水平和蛋白水平均被显著抑制,抑制率分别为70.0%和73.6%。选取注射ds LmCht5-1和ds GFP的4龄飞蝗表皮,进行免疫组化实验显示LmCht5-1定位于表皮细胞和旧表皮中,其功能失活引起旧表皮中几丁质不降解。【结论】获得飞蝗LmCht5-1多克隆抗体可特异性识别LmCht5-1,可用于Western blot和免疫组化检测。明确LmCht5-1在飞蝗4龄若虫蜕皮当天表达最高,定位于表皮细胞和旧表皮中。ds LmCht5-1可减少表皮细胞和旧表皮中LmCht5-1的表达,阻碍旧表皮中几丁质的降解。

【目的】制备非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p30蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）并初步分析其所识别的线性抗原表位，为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原，免疫6—8周龄BALB/c雌鼠，每两周免疫1次，共免疫3次，首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫，第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化，3次免疫后1 w断尾采血，间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体效价，选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫，3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4:1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原，间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，有限稀释法进行克隆纯化，直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞，以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗，进行间接免疫荧光试验（IFA）。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜，分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗，进行Western blotting分析，筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因，其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体，p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体，原核表达部分重叠的截短p30蛋白，最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原，以5株MAbs为一抗，以兔抗鼠HRP-IgG为二抗，通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原，经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示，5株MAbs(8F4、1D3、1H2、6C3和8E11)与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA试验呈阳性；Western blotting结果显示，5株MAbs均能够与ASFV感染的细胞呈阳性反应，与未感染病毒的细胞呈阴性反应。试验构建的p30截短体重组蛋白GST-p30ab以可溶和包涵体两种形式表达，而GST-p30bc仅以包涵体形式表达，以两组截短体融合蛋白为包被抗原，通过间接ELISA检测出MAbs 8F4、1H2和6C3与两个重组蛋白均能有效结合，证明MAbs 8F4、1H2和6C3抗原识别区域为两组截短蛋白重叠区域，即第120—153位氨基酸；MAbs 8E11与1D3则只能与GST-p30ab蛋白结合，证明MAbs 8E11与1D3抗原识别区域为两个重组蛋白的非重叠区域，即第86—119位氨基酸。【结论】本研究可溶性地表达了p30蛋白的第86—153位氨基酸截短体重组蛋白，制备了5株p30 MAbs，定位到2个p30蛋白抗原表位。结合ELISA和IFA，可建立十分可靠的ASFV及其抗体的检测手段。

以脱落酸（ＡＢＡ）为配基，分别通过其Ｃ１位和Ｃ４′位偶联的亲和层析柱对玉米根尖中的膜ＡＢＡ结合蛋白（ＡＢＢＰ）进行了纯化，其中，用Ｃ１偶联的亲和柱具有较高的纯化效率；对比了以尿素和硫氰化钾（ＫＳＣＮ）为解吸附剂的洗脱效果，发现使用后者（３ｍｏｌ／Ｌ）能得到纯净的ＡＢＢＰ；放射性配基结合分析（ＲＬ－ＢＡ）结果表明，经过亲和纯化后的ＡＢＢＰ具有受体的基本特性——专一结合ＡＢＡ的能力。以Ｃ１－ＡＢＢＰ和Ｃ４′－ＡＢＢＰ为免疫原，制备了２种多克隆抗体。

为在蛋白水平上探索紫花苜蓿MsWRKY33在抗逆性上的生物学功能,以紫花苜蓿品种中苜1号为材料,克隆了MsWRKY33抗原序列并对其性质和功能进行初步分析。对MsWRKY33蛋白的结构和特性进行生物信息学分析表明,MsWRKY33蛋白全长511 aa,主要由无规则卷曲和延伸链结构组成,不具有信号肽,是一个亲水性蛋白,免疫原性预测结果表明该蛋白免疫原性较强。结合序列的特异性选取适宜区段247～457 aa,利用该区段经蛋白纯化、免疫等步骤制备了MsWRKY33多克隆抗体。后续又采用Western Blotting的方法,对4种非生物胁迫(高盐、冷、PEG、ABA)下MsWRKY33蛋白的表达情况进行分析,发现4种胁迫均能诱导MsWRKY33蛋白表达增强,其中盐胁迫的诱导表达丰度最高,表明MsWRKY33在调控植物的高盐逆境响应中可能具有重要作用。试验结果为深入探索紫花苜蓿MsWRKY33基因功能及其对非生物逆境的抗性调控机制提供依据。

根据GenBank上其他物种的PPARγ基因序列设计兼并引物,从鲈肝脏cDNA中扩增得到鲈PPARγ基因cDNA序列1588bp,分析表明该基因的开放阅读框为1569bp,编码522个氨基酸,理论等电点6.06,分子量59.02ku。将鲈PPARγ氨基酸序列比对后发现与欧洲鲈同源性最高,为93.1%;与金头鲷的同源性为92.3%,与人同源性也达到为61.8%。用RT-PCR分析该基因组织表达模式,结果表明,鲈PPARγ主要分布于肝脏、鳃和脂肪组织。将鲈PPARγ开放阅读框1569bp序列克隆至原核表达载体pET-28a(+)构成pET-28a-PPARγ1569重组体,并转化大肠杆菌BL21(...