【目的】研究飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶(glucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase,GNA)的特性及生物学功能,为探讨飞蝗表皮几丁质的合成机制及研发新型绿色环保杀虫剂提供实验依据。【方法】采用生物信息学方法,在飞蝗EST数据库中搜索GNA的cDNA序列,并与其它物种GNA序列进行同源比较;设计飞蝗GNA特异性表达引物,分析5龄第2天不同组织样品间的表达差异及5龄第1天至第7天表皮中GNA表达量的变化;构建pET-28a(+)蛋白表达载体,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株中表达GNA重组蛋白,Ni柱亲和纯化重组蛋白并分析重组蛋...

【目的】β－Ｎ－乙酰氨基葡萄糖苷酶（β－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉＮｉｄａｓｅ，Ｎａｇ）是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类。研究旨在利用Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ杆状病毒表达系统获得高纯度ｌｍＮａｇ１蛋白并对其酶学特性进行分析，探究该酶在飞蝗（ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）生长发育过程中的生物学功能，为飞蝗绿色防控分子靶标研发提供理论与实践依据。【方法】根据ｌｍ Ｎａｇ１的ｃｄＮａ全长序列（ｇｅＮ ＢａＮｋ：ＪＸ８８８７２０．１）设计包含酶切位点Ｂａｍ Ｈ Ⅰ、ＨｉＮｄ Ⅲ和６×Ｈｉｓ标签的引物。采用Ｐｃｒ技术扩增包含开放阅读框的目标片段，双酶切后连接至ＰＦａｓｔ Ｂａｃ～（ｔｍ）－ｄ．．．

以D-果糖、葡萄糖、D-甘露糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)为效应物,研究它们对猪精液碱性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase,EC3.3.1.52)活力的影响及抑制机理.结果表明:在特定浓度范围内,低浓度的葡萄糖对NAGase活力表现为激活作用,而D-果糖、D-甘露糖和NAG对酶活力均表现为抑制作用,抑制程度从高到低依次为D-甘露糖、NAG、D-果糖;D-甘露糖表现为可逆的竞争型抑制,抑制常数KI为18.36 mmol·L-1;NAG表现为可逆的混合型抑制,抑制常数KI和KIS分别为16.98和55.26 mmol·L-1.

研究了湖北沼泽型母水牛在发情末期唾液中Ｎ－乙酰－β－Ｄ－氨基葡萄糖苷酶（ＮＡＧ）的变化与排卵的关系。结果表明，在ＮＡＧ活性峰出现前的酶单位为１８．９６±６．７３（ｎ＝１２８），临排卵前出现的活性峰的酶单位为６０．３７±１５．４６（ｎ＝１２８），两者之间的差异显著（Ｐ＜０．０１）。５头发情排卵典型的母水牛，在其发情末期唾液中ＮＡＧ的活性呈现规律性变化，在临排卵前出现一明显高峰，此前３～６ｈ尚出现一小峰。在母水牛发情末期待小峰出现而后下降时进行冷冻精液人工授精，２个冻配点的情期产犊率和受胎率分别为４５．８３％（２２／４８）和４５．００％（３６／８０）。

以甲醇、乙醇、异丙醇、甲醛和戊二醛为效应物,研究它们对中华绒螯蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响.结果表明:戊二醛对NAGase活力影响不大;低浓度的甲醇和乙醇对NAGase有激活作用;高浓度的甲醇、乙醇、异丙醇和甲醛对NAGase的作用为可逆抑制.甲醇、乙醇、异丙醇对NAGase表现出竞争性抑制,抑制常数(KI)分别为3.663、0.360和0.480 mol.L-1;甲醛表现为非竞争性抑制类型,其KI为0.288 mol.L-1.

【目的】分离纯化猪精液碱性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂,研究其理化性质。【方法】采用硫酸铵沉淀分级分离、DEAE-32阴离子交换柱层析、Sephadex G-100分子筛柱层析和CM-52阳离子交换柱层析方法,分离纯化猪精液的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶;采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯度鉴定和酶分子量测定;采用聚丙烯酰胺等电聚焦圆盘电泳法测定酶的等电点。【结果】经分离纯化获得比活力为17606.15U·mg-1、纯化倍数为270.53倍的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂。酶催化对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖(pNP-N...

河田鸡和艾维茵肉鸡的睾丸,经硫酸铵分级沉淀、DEAE-32离子交换柱层析,获得比活力为54.84 U.mg-1,纯化倍数为8.86的河田鸡睾丸N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)制剂.艾维茵肉鸡睾丸NAGase经Sephacry S-300凝胶过滤层析柱进一步纯化,获得比活力为171.50 U.mg-1,纯化倍数为19.8倍的NAGase制剂.以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学.结果表明:河田鸡和艾维茵肉鸡睾丸NAGase的最适pH分别为5.6、5.7,最适温度分别为55、50℃;NAGase分别在pH为3.0-9.2...

为探讨中华绒螯蟹蜕皮过程中的生理生化变化,采用生物化学和原子吸收方法,测定了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)蜕皮过程中鳃组织糖原、蛋白质、无机离子含量及N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性,结果显示:鳃组织糖原含量从蜕皮间期C期至蜕皮前D0期基本稳定,从蜕皮前D1期开始逐渐减低,直至蜕皮后A-B期降至最低。蛋白质含量从蜕皮间期C期至蜕皮前D1期保持稳定,在蜕皮前后(蜕皮前晚期D3-4期和蜕皮后A-B期)含量较高。鳃组织Ca2+含量由蜕皮间期至蜕皮前D3-4期含量降低,而于蜕皮后A-B期恢复到蜕皮间期水平。Mg2+含量在蜕皮过程中无显著变化,而Cu2+和Zn2+含量在蜕皮后A-B期...

山麻鸭的睾丸和肝脏经硫酸铵分级沉淀分离、DEAE-32离子交换柱层析,获得的肝脏N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase,EC3.2.1.52)比活力为85.30 U.mg-1,纯化倍数为10.48.睾丸NAGase再进一步通过Sephacryl S-300凝胶过滤纯化,获得的NAGase比活力为5537.00 U.mg-1,纯化倍数为59.20.睾丸NAGase经聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳,出现单一蛋白带,测定等电点pI为5.05.以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物研究酶催化底物水解的反应动力学.结果表明:山麻鸭睾丸和肝脏NAGase的最适pH分别为5....

为进一步探究KK-42缩短蜕皮周期的分子机制,本研究以日本沼虾幼虾为材料,通过RACE技术克隆了几丁质降解途径中的限速酶NAGase基因全长cDNA序列,定量测定了KK-42处理不同时间对表皮组织中NAGase mRNA相对表达量和酶活力的影响。序列分析结果显示,MnNAGase cDNA全长2536 bp,编码617个氨基酸。同源性分析显示,MnNAGase基因保守性较低,与凡纳滨对虾的相似度最高,仅为68%。系统进化分析显示,日本沼虾、三疣梭子蟹、凡纳滨对虾、中国明对虾聚为一个大类,凡纳滨对虾和中国明

【目的】研究蜕皮激素20E和保幼激素JH处理对家蚕5龄幼虫不同组织β-N-乙酰葡萄糖苷酶（β-N-acetylgucosaminidase，GlcNAcases）活性的影响，为深入解析家蚕GlcNAcases的生物学功能提供参考。【方法】利用微量注射器注射蜕皮激素20E和保幼激素JH，分别测定6、12、18、24和48 h家蚕幼虫血淋巴、脂肪体、中肠、表皮和丝腺中GlcNAcases的活性变化情况。【结果】在JH处理组，家蚕幼虫血淋巴GlcNAcases活性在12 h便开始显著增高，在18、24和48 h持续极显著高于对照组；在20E处理组，血淋巴GlcNAcases活性仅在24和48 h显著高于对照组。对于20E处理组和JH处理组，脂肪体组织GlcNAcases的活性变化情况相似，在6、12和18 h酶活性无显著变化，在24和48 h极显著高于对照组。经20E或JH处理后，中肠组织GlcNAcases活性在6和12 h均略高于对照组，但与对照组相比差异不显著；在18 h开始显著高于对照组，在24 h极显著高于对照组，随后在48 h酶活性降低至对照组水平。20E处理后，表皮GlcNAcases活性在12 h开始显著高于对照组，在18和24 h持续显著高于对照组，48 h酶活性降低至对照组水平。JH处理后，表皮组织GlcNAcases活性在12、18和24 h极显著低于对照组，在48 h恢复至对照组水平。丝腺组织中的GlcNAcases活性在20E处理12 h开始高于对照组，但差异不显著，随后酶活性持续增强，在18和24 h极显著高于对照组；在48 h有所降低，但仍显著高于对照组。JH处理12 h GlcNAcases活性开始降低，但与对照组相比差异不显著，18 h开始显著低于对照组，24和48 h持续极显著低于对照组。【结论】蜕皮激素20E和保幼激素JH对家蚕幼虫血淋巴、脂肪体和中肠中GlcNAcases活性具有一定的激活作用。在表皮和丝腺组织中，20E能促进并激活GlcNAcases的活性，而JH则抑制其的活性。这提示GlcNAcases在家蚕幼虫不同组织发挥的功能并不完全相同，并且不同激素对GlcNAcases活性的影响效果亦存在差异。

【目的】几丁质脱乙酰基酶(chitin deacetylase,CDA)是昆虫几丁质代谢系统的重要酶系,研究飞蝗(Locusta migratoria)几丁质脱乙酰基酶基因的分子特性和生物学功能,为新型农药靶标筛选提供科学依据。【方法】基于飞蝗转录组数据库,获得几丁质脱乙酰基酶基因的c DNA序列,将其与飞蝗基因组进行比对,绘制基因结构图。将其与赤拟谷盗CDAs序列进行比对,并采用Blast P和SMART软件进行功能域预测。将已鉴定的飞蝗CDAs分别与赤拟谷盗、果蝇、冈比亚按蚊、家蚕、中华稻蝗和云杉卷叶

草甘膦N-乙酰转移酶(glyphosate N-acetytransferase,GAT)是一种能够通过转乙酰基的反应将草甘膦代谢为低毒物质乙酰草甘膦的酶,在抗除草剂转基因作物中具有潜在的应用价值。通过将地衣芽孢杆菌Ba-cillus licheniformis(Weigmann)Chester AB 94036中的草甘膦N-乙酰转移酶(glyphosate N-acetyltransferase,GAT)基因克隆到大肠杆菌中,获得含有重组质粒pGEX 6p-1-gat的重组菌株。对重组菌株进行诱导表达,经过GST亲和层析纯化,获得约17 ku的目的蛋白。通过酶标仪和连续分光光度分析法,对GA...

通过水生动物源性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)强毒株J-1株与弱毒株MR-1株抑制差减杂交得到gneJ差减片段,该片段与创伤弧菌(Vibrio vulnificus)和人源嗜水气单胞菌的UDP-乙酰葡萄糖胺-4差向异构酶基因有较高的同源性。扩增完整的gneJ基因,进行分布检测并将其克隆至质粒pET32a(+),在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中进行异源表达,SDS-PAGE结果显示,重组表达蛋白的分子量约59.7kD,与理论推测值基本相同。酶活性分析表明,该重组蛋白可将UDP-乙酰葡萄糖胺转化为UDP-乙酰半乳糖胺,确证gneJ基因编码蛋白...

以亚硫酸钠(Na2SO3)、过氧化氢(H2O2)和尿素为效应物,研究它们对河蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响.结果表明,Na2SO3、H2O2和尿素对酶活力有不同程度的抑制作用.Na2SO3和H2O2对酶的抑制均表现为可逆反竞争性类型,它们对游离酶的抑制常数(KI)分别为254.00和136.78 mmol.L-1;尿素对酶的抑制表现为可逆的混合型抑制,它对游离酶的KI和对酶—底物复合物的抑制常数(KIS)分别为379.02和1182.00 mmol.L-1.