【目的】海藻糖酶（ｔｒｅｈａｌａｓｅ）可专一性地将一分子海藻糖水解成为两分子葡萄糖，在昆虫能量代谢和几丁质合成过程中发挥重要作用，因此，海藻糖酶已成为害虫控制的潜在靶标。本研究以重要农业害虫飞蝗（ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）为材料，探讨海藻糖酶基因的分子特性及生理功能，为飞蝗的有效治理提供理论依据。【方法】通过搜索飞蝗转录组和基因组数据库，获得４个海藻糖酶基因ｃＤＮａ全长序列，运用ｂｌａｓｔ、ｔｍｈｍｍ和ｓｉｇＮａｌＰ等相关软件分析其序列特征；利用ｃｌｕｓｔａｌＷ进行海藻糖酶全长氨基酸序列比对，ｍｅｇａ７构建海藻糖酶的系统进化树；运用ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａＮｓｃｒｉＰｔｉｏＮ－ｑｕａ．．．

【目的】在前期克隆了绿盲蝽水溶性海藻糖酶(ALTre-1)基因的基础上,以获得具有酶活性的重组蛋白,明确酶促反应的最佳pH值及最适温度,为绿盲蝽海藻糖酶分子调控机制及其抑制剂的应用研究奠定基础。【方法】将含有绿盲蝽ALTre-1基因的T载体经Nde I和Not I双酶切,构建ALTre-1基因原核表达载体(pET28a-ALTre-1),表达载体经诱导表达和蛋白纯化,获得ALTre-1功能区纯化蛋白。在蛋白浓度为0.3 mg·mL-1的条件下,以海藻糖为底物,对纯化得到的重组Tre-1蛋白进行活性检测,确定其酶促反应的最佳pH值和最佳温度。【结果】ALTre-1基因在大肠杆菌中BL21中能够高...

【目的】昆虫海藻糖酶能够调控几丁质代谢并控制蜕皮过程。本研究通过TRE表达被抑制后,检测褐飞虱(Nilaparvata lugens)蜕皮状况、几丁质含量及几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)和几丁质酶(chitinase,Cht)基因表达情况,探究不同的海藻糖酶(trehalase,TRE)在褐飞虱表皮中对几丁质代谢的调控作用。【方法】采用RNAi技术,以实验室饲养种群褐飞虱为材料,通过向其体内注射双链RNA(dsRNA)分别抑制单个海藻糖酶基因或同时抑制多个海藻糖酶基因,注射48 h

【目的】克隆小峰熊蜂(Bombus hypocrita)可溶型海藻糖酶基因(soluble trehalase,Tre-1)全长c DNA序列,预测该基因及其编码蛋白的理化性质,明确该基因在小峰熊蜂不同组织及不同发育时期的表达特性,为研究该基因在小峰熊蜂生长发育中的生物学功能奠定基础。【方法】根据地熊蜂(B.terrestris)和B.impatiens可溶型海藻糖酶基因Tre-1编码蛋白的保守区序列,利用Primer Premier 5.0设计简并引物扩增得到小峰熊蜂保守区片段;随后根据该片段设计基因特异性引物,用RACE方法获得5'端和3'端片段。在此基础上,根据RACE扩增所得片段和保守...

【目的】几丁质脱乙酰基酶(chitin deacetylase,CDA)是昆虫几丁质代谢系统的重要酶系,研究飞蝗(Locusta migratoria)几丁质脱乙酰基酶基因的分子特性和生物学功能,为新型农药靶标筛选提供科学依据。【方法】基于飞蝗转录组数据库,获得几丁质脱乙酰基酶基因的c DNA序列,将其与飞蝗基因组进行比对,绘制基因结构图。将其与赤拟谷盗CDAs序列进行比对,并采用Blast P和SMART软件进行功能域预测。将已鉴定的飞蝗CDAs分别与赤拟谷盗、果蝇、冈比亚按蚊、家蚕、中华稻蝗和云杉卷叶

【背景】海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)在海藻糖合成中起着重要作用,其能够介导海藻糖代谢调控几丁质合成及昆虫发育。【目的】本研究通过抑制白背飞虱(Sogatella furcifera)TPS的表达,检测RNAi沉默SfTPS效果,观察白背飞虱蜕皮状况,测定几丁质含量及几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)基因的定量表达,探究SfTPS在白背飞虱几丁质合成中的潜在调控作用。【方法】利用注射法RNAi技术,以实验室饲养多年的白背飞虱种群为试验材料,体外合成两个SfTPS(SfTPS1和SfTPS2)与GFP的双链RNA(dsRNA)后,分别注射到白背飞虱体内抑制TPS。首先,在dsRNA注射后48 h采用Trizol法提取白背飞虱的总RNA,反转录并合成第一链DNA后,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测TPS表达沉默情况,以确定RNAi的效果;其次,测定dsRNA注射后48 h和72 h白背飞虱整体几丁质含量并对翅发育畸形虫体进行拍照;最后,采用qRT-PCR技术检测白背飞虱SfCHS在mRNA水平上的相对表达量变化,分析SfTPS1和SfTPS2在几丁质合成调控中的作用。【结果】与注射dsGFP相比较,dsSfTPS1和dsSfTPS2的RNA注射后,能够促进SfCHS表达量上升,几丁质含量增加,白背飞虱成虫翅出现畸形。qRT-PCR结果显示,单个SfTPS dsRNA注射后本基因的表达能够被极显著抑制,与注射dsGFP相比,不足对照组表达量的30%,且单个SfTPS的dsRNA注射后,另外一个SfTPS表达同样显著下降;dsSfTPS1和dsSfTPS2注射后,白背飞虱成虫翅均为长翅,出现一定比例的翅卷曲等畸形情况,其后48 h和72 h产生一定的死亡率;几丁质含量检测发现,SfTPS1和SfTPS2的dsRNA注射后72 h,几丁质含量显著上升。与注射dsGFP对照组相比较,SfCHS1与SfCHS1a表达量在dsSfTPS1注射后72 h极显著上升,在dsSfTPS2注射后48 h和72 h时极显著上升,且dsSfTPS1和dsSfTPS2注射后SfCHS1b的表达极显著增加。【结论】SfTPS能够通过调控白背飞虱几丁质合成酶基因的表达来控制几丁质的合成,研究结果有助于评价SfTPS在白背飞虱等昆虫中的调控作用并作为潜在控害靶标,为进一步开展和筛选有效的海藻糖合成酶抑制剂控制白背飞虱等害虫提供理论依据。

闹羊花素 Ⅲ (Rhodojaponin Ⅲ ,简称R Ⅲ )能显著降低 5龄菜青虫血淋巴和肌肉海藻糖含量。R Ⅲ以每虫 1～ 10 μg处理试虫后 6 0h ,血淋巴海藻糖酶活性明显受抑制。R Ⅲ对肌肉海藻糖酶活性的影响依剂量不同而异。处理后 6 0h内 ,10 μg处理时无明显影响 ,3～ 5 μg处理则有可逆性激活作用 ,1μg处理则在 6 0h内保持激活作用

【背景】昆虫海藻糖合成酶基因是昆虫海藻糖合成的主要基因,大多数昆虫中只拥有一个海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)基因,部分昆虫存在一个海藻糖-6-磷酸酯酶(trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP)基因。前期研究发现褐飞虱(Nilaparvata lugens)中拥有两个TPS,对其功能研究发现TPS不仅能够调控海藻糖代谢,还可介导海藻糖酶调控几丁质合成与降解途径,控制昆虫的蜕皮过程。【目的】通过对褐飞虱转录组测序分析获得了一个新的TPS,检测该基因在褐飞虱不同发育阶段的表达情况,探究该基因的功能与前期发现的两个TPS的区别。【方法】对获得的新TPS基因序列采用克隆技术获得全长c DNA序列,经验证正确后,对其蛋白的一级、二级、三级结构及与其他昆虫的TPS进行比对分析,最后采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术测定3个不同TPS在褐飞虱不同发育阶段的表达,并采用RNA干扰(RNAi)技术抑制TPS3的表达。【结果】在前期研究的基础上,克隆出一个新的TPS,并命名为TPS3。TPS3开放阅读框长度为2 352 bp,编码783个氨基酸,预测蛋白分子量为88.9 kD,等电点为5.47,具有亲水性结构。生物信息学分析表明,褐飞虱3个TPS蛋白具有较高的同源性,都具有TPS和TPP两个保守结构域及其他特征序列,并且α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲所占的比例较为接近。褐飞虱不同发育阶段3条TPS的相对表达量不同,TPS1的相对表达量从4龄0 h开始逐渐上升,至成虫阶段达到最高,TPS2的相对表达量从4龄末期开始明显上升且在整个5龄阶段都有较高的表达,TPS3的相对表达量在5龄末期和成虫初期较高。单独干扰褐飞虱TPS3 48 h后被干扰基因的相对表达量下降,ds TPS3能有效抑制TPS3的表达。【结论】在褐飞虱中发现一个新的TPS(TPS3),其与褐飞虱中已经报道的TPS1和TPS2具有较高的同源性。不同发育阶段表达结果表明,3个TPS在发育过程中行使的功能不同。RNAi能够有效抑制TPS3的表达并导致褐飞虱蜕皮障碍和翅发育畸形。

【目的】丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PYK)是一种调节性糖酵解酶,负责调节糖酵解和糖异生之间的平衡,具有重要的生理作用。本研究通过分析异色瓢虫(Harmonia axyridis)3条HaPYK的序列结构,并结合RNA干扰(RNAi)技术,探讨HaPYK在瓢虫体内的生物学功能。【方法】基于从异色瓢虫全基因组中获得的3条HaPYK序列(被分别命名为HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2),通过生物信息学方法分析其理化性质和序列结构,以及与其他昆虫之间的同源性。然后采用显微注射的方法将体外合成的dsRNA导入羽化第1天成虫体内,在注射后48和72 h分别收集试验材料,提取虫体总RNA后进行反转录,随后采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术测定3个HaPYK的表达水平以评估RNAi效果,并检测与海藻糖代谢相关基因的表达水平,最后检测葡萄糖、糖原、海藻糖含量以及两种海藻糖酶的活性。【结果】HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2的开放阅读框分别为1 350、1 569、1 656 bp;蛋白大小分别为449、522、551 aa,理论等电点分别为5.04、5.02、5.01。保守结构域预测表明3条HaPYK均属于Pyruvate_kinase超家族。HaPYK二级结构主要是α-螺旋和无规则卷曲,另外也含有延伸链和β-转角。3条序列的寡聚物类型均为同源四聚体。系统进化树显示,HaPYK与同为鞘翅目的昆虫具有较近的亲缘关系,如马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)和赤拟谷盗(Tribolium castaneum)。注射ds HaPYK1-1后,HaPYK1-2和HaTRE1-4的表达量显著下调,而HaPYK2、HaTRE1-1、HaTRE1-2、HaTRE2-like、HaTPS的表达量显著上调;注射ds HaPYK1-2后,HaTRE1-1、HaTRE1-2、HaTRE1-3、HaTRE1-5、HaTRE2、HaTPS的表达量显著上调;注射ds HaPYK2后,仅HaTRE1-1表达量在48 h表现为显著上调,HaTRE1-3、HaTRE1-4、HaTRE1-5、HaTRE2、HaTRE2-like的表达量均下调。与对照组相比,在ds HaPYK1-2组中48 h时可溶性海藻糖酶(TRE1)活性显著降低,海藻糖和糖原含量显著增加;在ds HaPYK1-1或ds HaPYK2组中48 h时葡萄糖含量减少,72 h时葡萄糖、海藻糖含量增加,膜结合型海藻糖酶(TRE2)活性显著提高;在ds HaPYK2组48 h时,海藻糖含量显著减少,而糖原含量显著增加。【结论】异色瓢虫体内存在3个HaPYK,通过导入外源ds HaPYK能成功干扰靶标基因的表达水平,且抑制表达后海藻糖代谢会受到影响,但3个HaPYK的调控机制不尽相同。

【目的】研究飞蝗(Locusta migratoria)细胞色素P450(CYP450)第四家族(CYP4)中3个基因的功能。【方法】以飞蝗为材料,依据飞蝗EST数据库P450基因预测序列设计引物,利用RT-PCR技术克隆飞蝗细胞色素P450基因的cDNA全长序列,命名为CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1(GenBank登录号:KF857162、KF857163和KF857164)。采用实时定量PCR技术分析CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1在飞蝗各发育阶段以及不同组织中mRNA的表达水平。应用RNA干扰技术沉默CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1,实时定量P...

对不同滞育阶段麦红吸浆虫海藻糖酶和山梨醇脱氢酶的活性进行了测定。结果表明,麦红吸浆虫落土滞育前,其幼虫的海藻糖酶活性最高,入土后其活性迅速下降,到9月中旬活性开始上升,随后呈下降趋势,之后又迅速升高至滞育年周期中的最高水平;不同滞育阶段麦红吸浆虫从脱离麦穗到当年11月以前,一直未检测到山梨醇脱氢酶活性,翌年2~4月,山梨醇脱氢酶的活性急剧增加,至04-20达到整个滞育期间的最高值(0.504 2OD/(mL.m in));相同滞育阶段,裸露幼虫海藻糖酶活性和山梨醇脱氢酶活性较结茧幼虫略高,并表现出相同的变化趋势;不同滞育年限麦红吸浆虫海藻糖酶活性和山梨醇脱氢酶活性无明显差异。

【目的】研究海藻糖及海藻糖酶在B型烟粉虱寄主谱扩张及与温室粉虱的竞争适应过程中的作用。【方法】以番茄饲养的B型烟粉虱与温室粉虱转移取食嗜好(棉花、甘蓝)或非嗜好(玉米)寄主植物后,其体内海藻糖含量及海藻糖酶活性的变化和响应。【结果】改变寄主会使B型烟粉虱和温室粉虱的海藻糖含量降低,其中棉花的作用最为明显,分别比对照减少了33%和25%;将植物种类转换为B型烟粉虱嗜好、温室粉虱亦可利用的寄主棉花或B型烟粉虱嗜好而温室粉虱非嗜好的寄主甘蓝,两种粉虱海藻糖含量的变化基本一致,而在两种粉虱非嗜好寄主玉米上B型烟粉虱(112.6%)较温室粉虱(60.8%)的恢复能力强、稳定性能好。尽管改变寄主对两种粉虱...

为了获得一个优良的玉米抗旱育种基因资源,借助于生物信息学手段和分子生物学实验操作技术,从木棉植物中获得了一个编码海藻糖-6-磷酸合成酶的抗旱基因序列。根据玉米对密码子使用的偏爱性,合成了1个可用于玉米转化并提高其耐旱性的新的海藻糖-6-磷酸合成酶基因,进一步通过DNA分子的酶切和连接等操作将该基因构建成表达质粒,再导入大肠杆菌和酵母细胞以鉴定其是否能在原核和真核细胞中表达。最后该基因被构建到植物表达载体上,并转入农杆菌细胞。结果表明,新合成基因全长为2 586 bp,包含完整的开放阅读框,编码861个氨基酸;构建出的原核和真核表达质粒与预期的结果相符,该基因可用于细胞转化试验;该新合成基因能在大肠杆菌和酵母细胞中有效表达出海藻糖-6-磷酸合成酶;该基因被成功构建到植物表达载体p CAMBIA-2300上,并转入了农杆菌细胞LBA4404工程菌株。综合上述结果认为,获得了1个新的海藻糖-6-磷酸合成酶基因,该基因能在原核和真核细胞中有效表达出海藻糖-6-磷酸合成酶,构建的植物基因表达质粒可以直接用于玉米抗旱转基因育种。

【目的】ＭｉｃｒｏｒＮＡｓ（ＭｉｒＮＡｓ）是一类长度约２２ Ｎｔ的非编码ｒＮＡ，通过转录后调控的方式在多种生命活动中发挥重要功能。ＡｒｇｏＮＡｕｔｅ１（Ａｇｏ１）蛋白作为ＭｉｒＮＡ沉默复合物（ＭｉｒＮＡ ｓｉｌｅＮｃｉＮｇ ｃｏＭｐｌｅｘ ｒｉｓｃ）的重要组成部分，在ＭｉｒＮＡ调控通路中起着关键作用。论文旨在研究Ａｇｏ１的生物学功能及其对飞蝗（ｌｏｃｕｓｔＡ ＭｏｒＡｔｏｒｉＡ）生长发育的影响，为探索昆虫ＭｉｒＮＡ的生物合成和农业害虫的有效控制提供理论依据。【方法】采用生物信息学方法在飞蝗转录组数据库中获得ｌＭ Ａｇｏ１ ｃ ＤＮＡ序列；使用在线蛋白翻译软件（ｅｘ ｐＡｓｙ）对ｌＭ Ａｇｏ１进．．．

【目的】基于飞蝗(Locusta migratoria)转录组数据库搜索并克隆获得飞蝗表皮蛋白基因LmNCP1(nymph cuticle protein 1),分析其序列特征和表达特性,通过蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)诱导和干扰20E受体基因LmEcR表达研究其表达调控,并基于RNA干扰(RNAi)方法分析其生物学功能,为阐明该基因在飞蝗表皮发育过程中的作用提供理论依据。【方法】依据飞蝗转录组数据库获得表皮蛋白基因LmNCP1,结合RT-PCR技术克隆获得其全长开放阅读框(O