【目的】通过制备飞蝗(Locusta migratoria)几丁质酶5-1(LmCht5-1)的多克隆抗体,建立飞蝗体内LmCht5-1蛋白水平检测方法,分析LmCht5-1在4龄飞蝗的表达特性及组织定位。【方法】采用MEGA软件对LmCht5-1和LmCht5-2氨基酸序列进行比对,利用Expression网站对LmCht5-1氨基酸序列进行抗原表位预测分析,获得LmCht5-1抗原结构区域;以飞蝗c DNA为模板,通过PCR扩增LmCht5-1的抗原片段;同时通过酶切连接构建含有鸡血清白蛋白OVA的载体p ET32a-OVA;然后通过酶切连接将LmCht5-1插入到p ET32a-OVA载体构建p ET32a-OVA-LmCht5-1;将p ET32a-OVA-LmCht5-1转入表达菌株BL21(DE3)中,IPTG诱导表达重组蛋白OVA-LmCht5-1;利用Ni-NTA纯化后免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。通过ELISA方法检测抗体效价;利用Western blot检测抗体特异性。提取4龄飞蝗不同日龄表皮,采用Western blot分析LmCht5-1蛋白表达模式。对4龄飞蝗注射ds LmCht5-1,检测蛋白水平LmCht5-1表达量,并通过免疫组化方法对LmCht5-1进行定位及功能分析。【结果】通过LmCht5-1和LmCht5-2序列比对和抗原表位预测分析,获得LmCht5-1的471—533AA可作为抗原区域;通过酶切连接分别获得p ET32a-OVA和p ET32a-OVA-LmCht5-1。经诱导表达和纯化后获得重组蛋白OVA-LmCht5-1,分子量为71.34 k D;免疫后制备多克隆抗体OVA-LmCht5-1,ELISA检测效价为1﹕102 400。多克隆抗体OVA-LmCht5-1用于Western blot检测时可特异性识别LmCht5-1,与LmCht5-2蛋白无交叉反应。利用Western blot方法检测4龄若虫各日龄表皮中LmCht5-1蛋白的表达,发现LmCht5-1蛋白随发育日龄其表达量逐渐增加,在蜕皮当天达到峰值,蜕皮后快速降至最低点。对飞蝗若虫N4D2注射ds LmCht5-1,检测到在N4D5时,LmCht5-1的转录水平和蛋白水平均被显著抑制,抑制率分别为70.0%和73.6%。选取注射ds LmCht5-1和ds GFP的4龄飞蝗表皮,进行免疫组化实验显示LmCht5-1定位于表皮细胞和旧表皮中,其功能失活引起旧表皮中几丁质不降解。【结论】获得飞蝗LmCht5-1多克隆抗体可特异性识别LmCht5-1,可用于Western blot和免疫组化检测。明确LmCht5-1在飞蝗4龄若虫蜕皮当天表达最高,定位于表皮细胞和旧表皮中。ds LmCht5-1可减少表皮细胞和旧表皮中LmCht5-1的表达,阻碍旧表皮中几丁质的降解。

【目的】几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)是昆虫几丁质合成过程中的关键酶之一,由于高等动物不存在该酶,而被认为是设计安全高效杀虫剂的潜在靶标。论文在已克隆得到飞蝗几丁质合成酶2基因cDNA序列(LmCHS2,GenBank登录号:GU067731)的基础上,进一步深入探讨该基因在不同发育时期的表达特性、功能及调控,为基于RNA干扰技术的飞蝗有效控制提供科学依据。【方法】根据已知LmCHS2基因核苷酸序列,设计特异性表达引物,运用RT—qPCR技术研究该基因在卵、若虫及成虫期的表达特性;体外合成LmCHS2的dsRNA后,分别注射至成虫期第1天的雌虫和雄虫,收集第5天的中肠样...

【目的】研究东亚飞蝗几丁质酶家族基因的时空表达特性及其在蜕皮发育中的生物学功能,筛选在飞蝗发育过程中致死性的几丁质酶基因,为实现基于RNAi的飞蝗有效控制提供重要的基础数据。【方法】在东亚飞蝗EST数据库搜索几丁质酶基因片段,用生物信息学方法分析所获得的基因片段序列;以飞蝗不同龄期第4天若虫和5龄东亚飞蝗不同组织部位为材料提取RNA并反转录为cDNA,应用RT-PCR方法研究时空表达特性;选取在表皮高表达的几丁质酶基因LmCht6,采用RNA干扰方法研究其生物学功能。【结果】基于东亚飞蝗EST库搜索和进一步的序列分析,共获得7条几丁质酶基因片段;不同组织部位与不同龄期RT-PCR结果表明这7条...

为了对马铃薯蔗糖磷酸合成酶(SPS)编码蛋白StSPS1进行原核表达及多克隆抗体制备。从四倍体马铃薯品种川芋10号的块茎中克隆出了StSPS1基因，该基因编码区全长为3 165 bp,编码蛋白的长度为1 055 aa。随后基于构建的His标签融合表达载体PET30a-StSPS1,进行了StSPS1蛋白的诱导、变性、纯化、复性及兔免疫试验。结果发现，StSPS1蛋白分子量约为119.62 ku,在可溶性上清中的表达极少，主要在不溶的沉淀中表达，最佳的诱导条件为37℃下用0.5或1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h。由于StSPS1为包涵体蛋白，故对其进行包涵体变性处理，并利用His标签纯化出了与目的条带大小相符的蛋白，同时通过His抗体进行了蛋白质免疫印迹(WB)试验，发现在119.62 ku处检测到目标条带，说明StSPS1包涵体蛋白纯化成功。最后，通过将透析复性后的StSPS1蛋白注射进兔子皮下组织中，成功免疫出2个StSPS1的抗体，经过WB鉴定发现2个抗体均能在抗原和川芋10号叶片的总蛋白中杂出目标条带。综上，对马铃薯StSPS1蛋白进行了诱导及纯化，并成功制备了StSPS1蛋白的兔多克隆抗体。

钠/葡萄糖共转运载体1(sodium/glucose cotransporter 1,Sglt1)是协助葡萄糖吸收的主要蛋白。实验首先采用RT-PCR获取sglt1基因全长,克隆至PGME-T载体进行序列及免疫原性分析,选择长度为92个氨基酸(544～637)的多肽作为目的片段(sglt1-P)),扩增sglt1-P,引入双酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ后,连接至pET-32a(+)上,构建表达载体pET-32a(+)-sglt1-P,转化至E.coli Rosetta中,获得重组基因工程菌,通过IPTG诱导表达,获得目标多肽,并以此为抗原制备Sglt1特异性抗体。SDS-PAGE电泳分析表明...

为研究草鱼补体蛋白5a (complement component 5a,C5a)、补体蛋白5a受体(C5a receptor,C5aR)和凝血因子Ⅱ(blood coagulation factorⅡ，FⅡ)在感染草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)时的蛋白表达和相互作用，针对草鱼C5a和FⅡ蛋白构建了原核表达体系、针对草鱼C5aR蛋白构建C5aR-KLH偶联物，纯化蛋白，免疫日本大耳白兔制备3种蛋白的多克隆抗体。用蛋白质印迹(Western blot)、免疫共沉淀(Co-IP)和拉下(pull down)实验检测3种蛋白表达与互作关系，Western blot结果显示，C5a和C5aR在健康草鱼的肝脏、脾脏、肾脏、头肾、肠、鳃和肌肉中均有蛋白表达，FⅡ在肝脏、脾脏和肠中表达，而在肾脏、头肾、鳃和肌肉中不表达；在感染GCRV的草鱼肝脏组织中C5a、C5aR和FⅡ蛋白均随病程进展呈现上升趋势。Co-IP结果显示，在GCRV处理后，C5a、C5aR和FⅡ蛋白具有相互作用关系。pull down结果显示，C5a pull down共鉴定得到C3、RIG-I等28种候选蛋白，C5aR pull down共鉴定得到转醛醇酶、巨球蛋白等24种候选蛋白。该研究为深入探讨C5a、C5aR和FⅡ互作调控关系以及进一步探索补体和凝血级联系统中3个关联蛋白响应GCRV感染的作用机制奠定了基础。

【目的】LmKnickkopf3-5′(LmKnk3-5′)是飞蝗(Locusta migratoria)蜕皮发育中重要的表皮蛋白。本文旨在制备LmKnk3-5′特异抗体并对其进行组织定位,为LmKnk3-5′生物学功能研究提供蛋白水平的证据,同时为进一步深入探究LmKnk3-5′与其他表皮蛋白在飞蝗表皮形成过程中的协同作用打下基础。【方法】首先比对飞蝗Knickkopf(Knk)家族4个基因LmKnk、LmKnk2、LmKnk3-FL和LmKnk3-5′的氨基酸序列,选取LmKnk3-5′的3段特异抗原序列R1、R2和R3,设计包含Bam H I、Hind III酶切位点的引物,以LmKnk3-5′全长cDNA为模板,PCR获得LmKnk3-5′的特异抗原片段;然后将特异抗原片段与pET-32a经双酶切、T4连接酶连接、测序验证、成功构建重组质粒后,转入BL21(DE3)表达菌株中,加入IPTG(终浓度0.5 mmol·L-1)低温(16℃)诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况;接着扩大培养可在菌体裂解液的上清中表达重组融合蛋白的大肠杆菌,提取蛋白并用Ni-NTA对其进行纯化,之后再用纯化后的重组特异抗原免疫小鼠4次,获得anti-LmKnk3-5′多克隆抗体,ELISA法对其进行效价检测,并用Western blot法检测其特异性。取飞蝗5龄若虫第8天表皮,制备石蜡切片,通过免疫组化法对LmKnk3-5′蛋白进行组织定位。【结果】通过氨基酸序列比对,选取LmKnk3-5′的特异抗原区域R1、R2和R3,分别包含208、147和131个氨基酸残基,蛋白理论分子量分别为24.0、17.0和14.8 kD。酶切连接后,成功获得pET-32a-R1、pET-32a-R2和pET-32a-R3重组质粒。诱导表达检测,发现只有含pET-32a-R2的表达菌在菌体裂解液的上清液中大量表达重组蛋白。将其扩大培养纯化后获得R2重组融合蛋白,免疫小鼠取抗血清进行效价检测,抗体效价高达1﹕512 000,可满足抗体使用需求。Western blot结果表明,注射ds LmKnk3-5′后飞蝗体壁LmKnk3-5′的蛋白表达显著减少,表明anti-LmKnk3-5′抗体特异性良好。免疫组化试验结果表明,表皮蛋白LmKnk3-5′在飞蝗腹部体壁皮细胞及新表皮中均有分布,特别是新合成的外表皮顶端。【结论】成功获得飞蝗LmKnk3-5′多克隆抗体,证明其特异性良好。LmKnk3-5′在飞蝗腹部体壁新合成的外表皮顶端分布较多。研究结果为飞蝗表皮蛋白LmKnk3-5′功能研究提供了蛋白水平的证据。

【目的】体外真核表达飞蝗(Locusta migratoria)几丁质脱乙酰基酶1和2(chitin deacetylase 1and 2,LmCDA1和LmCDA2)并测定其酶活性,为进一步明确飞蝗LmCDA1和LmCDA2在几丁质降解途径中的生理功能及研发新型绿色环保杀虫剂提供依据。【方法】使用BLASTP和SMART软件在线预测LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的结构域;PCR克隆获得目的基因LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的全长序列,并分别构建p Fast Bac-LmCDA

为深入研究鹅催乳素受体(PRLR)的功能,构建了含鹅PRLR胞外域编码序列exPRLR的原核表达质粒exPRLR-pET-28a(+),通过转化E.coli Roster建立了稳定的原核表达系统,在IPTG诱导下获得了PRLR胞外域的重组exPRLR。以重组exPRLR为抗原免疫家兔,获得了兔抗鹅exPRLR的抗血清。Western blot分析证明该抗血清可特异识别由原核生物表达的重组exPRLR。进一步分析成年母鹅的组织蛋白,发现成年鹅中可能至少存在3种相对分子质量不同的PRLR蛋白异形体。

[目的]将玉米异分支酸合成酶1(ZmICS1)及系统获得抗性缺陷1(ZmSARD1)进行原核表达和纯化,并免疫家兔获得多克隆抗体,为深入研究ZmICS1和ZmSARD1在玉米抵抗病原菌胁迫中的功能奠定基础。[方法]克隆玉米ZmICS1和Zm SARD1基因CDS区,连接到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌表达菌株Rosettgami2(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达His_(×6)-ZmICS1和His_(×6)-ZmSARD1重组蛋白,以透析纯化后的重组蛋白为抗原免疫家兔,制备多克隆抗体,并进行验证和检测。[结果]成功构建了原核表达载体pET-28aZmICS1和pET-28a-ZmSARD1,于37℃、0.84 mmol/L IPTG在大肠杆菌表达菌株Rosett-gami2(DE3)中诱导出His_(×6)-ZmICS1和His×6-ZmSARD1重组蛋白。纯化蛋白免疫家兔,所得ZmICS1抗体能够检测到3 ng的His_(×6)-ZmICS1,ZmSARD1抗体能检测到低至0.3 ng的His_(×6)-ZmSARD,且分别能特异性地检测玉米B73原生质体过表达的ZmICS1和ZmSARD1蛋白。[结论]成功制备了玉米ZmICS1、ZmSARD1多克隆抗体,可用于玉米内源ZmICS1和ZmSARD1蛋白含量的检测。

【目的】克隆中国水仙几丁质酶基因,分析其在水仙不同组织中的表达,为提高中国水仙的抗病性提供参考。【方法】利用RT-PCR技术克隆得到中国水仙几丁质酶基因,对其序列及编码氨基酸序列进行生物信息学分析,通过qRT-PCR分析该基因在感染基腐病、病毒病及褐斑病中国水仙根、叶中的表达。【结果】中国水仙几丁质酶基因的cDNA序列长768bp,编码230个氨基酸,其编码蛋白的分子质量为25.4ku,理论等电点为9.04,为不稳定蛋白,亲水性强,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主。该基因编码的蛋白与荷兰芹几丁质酶蛋白的亲缘关系最近,隶属于糖苷水解酶19家族,与溶菌酶相似超家族基因的保守结构域类似,推测其可能是...

为探讨玉米AGPL2在籽粒发育时期淀粉积累过程中的功能机制,通过AGPL2基因克隆和构建带有GST标签的原核表达载体PGEX-6 T-1-AGPL2,并利用大肠杆菌诱导表达体系,用0. 5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在28℃条件下诱导表达6 h后,GST-AGPL2融合蛋白能够得到高水平表达,然后利用GST(Glutathione S-transferase)标签蛋白纯化介质进行亲和层析纯化,能够得到质量较高的GST-AGPL2融合蛋白;利用纯化所得的GST-AGPL2重组蛋白免疫新西兰大白兔制备了AGPL2多克隆抗体,分离并纯化抗血清,然后用rTEV Protease去除抗原GST-AGPL2融合蛋白的GST标签,并用纯化后的AGPL2多克隆抗体进行Western Blot检测,结果发现,AGPL2多克隆抗体具有较高特异性和灵敏性,可用于检测纳克级抗原蛋白;并利用Western Blot方法研究了AGPL2蛋白在玉米不同组织和不同授粉时期胚乳中的分布和表达模式,结果显示,AGL2蛋白在玉米不同组织中的表达具有组织特异性,且在胚乳中含量最高。AGPL2蛋白在玉米胚乳不同授粉时期表达量先增加后降低,且在授粉中期达到最大值。其结果与玉米籽粒发育过程中淀粉的积累规律一致,说明AGPL2主要存在于玉米胚乳中,且可能参与淀粉的合成,也说明AGPL2多克隆抗体具有很好的特异性,能够识别玉米体内的AGPL2抗原。

为阐明GmWRKY50转录因子在大豆与大豆花叶病毒(SMV)互作过程中的作用机制,以大豆叶片的RNA为模板,利用PCR技术克隆了GmWRKY50基因的编码区全长,利用MEGA 7.0软件对不同物种中GmWRKY50的相似氨基酸序列进行比对并进行系统进化树分析,通过原核表达技术,构建pColdⅡ-GmWRKY50重组质粒,转化大肠杆菌BL21后,利用IPTG对带有His标签的GmWRKY50重组蛋白进行诱导,经Ni-NTA柱对重组蛋白进行纯化,收集纯化后的重组蛋白进行多克隆抗体的制备,通过Western Blotting检测GmWRKY50在SMV侵染前后的表达水平变化。结果表明,GmWRKY50基因的CDS全长为495 bp,编码165个氨基酸,在N端含有一个WRKY结构域,属于WRKY DNA-binding结构域蛋白。序列比对及系统进化树分析表明,大豆GmWRKY50与拟南芥AtWRKY50同源关系最近;IPTG浓度为0.5 mmol/L,诱导时间为4 h,重组蛋白的诱导效果良好,利用镍离子亲和纯化获得与His蛋白标签融合的目的蛋白,具有较高的可溶性。以融合蛋白为抗原制备的多克隆抗体可以特异性结合GmWRKY50蛋白,GmWRKY50蛋白在不亲和组合中受SMV侵染诱导而上调表达,为进一步研究转录因子GmWRKY50在大豆抵御SMV侵染过程中的功能奠定了基础。

【目的】制备灰茶尺蠖(Ectropis grisescens Warren)固醇转运蛋白(SCP)的多克隆抗体,并检测灰茶尺蠖SCP2蛋白在灰茶尺蠖不同组织中的表达情况,为进一步研究SCP2对胆固醇的转运和利用机制以及其生物学功能奠定基础。【方法】以灰茶尺蠖5龄1 d幼虫中肠cDNA为模板,应用PCR技术扩增得到EgSCP2片段,将EgSCP2目的片段连入pMD18-T载体后进行测序,利用DNAMAN软件分析该基因序列的准确性及编码蛋白的分子质量。以测序正确的EgSCP2基因片段为模板,扩增EgSCP2的开放阅读框,通过BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶连接到原核表达载体pET32a中,并转化大肠杆菌BL21 (DE3)进行原核表达,离心收集并超声波破碎菌体,取上清液和沉淀分别进行SDS-PAGE检测,在不同温度、不同IPTG终浓度条件下优化EgSCP2重组蛋白表达条件。经Ni-NTA树脂层析柱纯化得到EgSCP2重组蛋白。将该蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗EgSCP2血清抗体,采用间接ELISA方法测定了该血清抗体的效价,并通过Western blotting检测EgSCPx和EgSCP2蛋白在灰茶尺蠖不同组织中的表达情况。【结果】扩增得到EgSCP2基因开放阅读框(ORF)全长为441 bp,编码146个氨基酸,预测编码蛋白的分子质量为16 ku。优化蛋白诱导条件的试验表明,28℃、IPTG浓度为1.0 mmol/L时,EgSCP2重组蛋白表达量最高,该条件下通过大肠杆菌表达的EgSCP2重组蛋白分子质量约为34 ku,其大小与预期结果一致,且其在上清液和沉淀中均有表达。间接ELISA法检测结果表明,制备的兔抗EgSCP2抗体具有较好的灵敏度,效价达到1∶256 000。Western blotting检测结果显示,58 ku EgSCPx在5龄2 d灰茶尺蠖的表皮、脂肪体和中肠均有表达,且在中肠的表达量远高于表皮和脂肪体;16 ku EgSCP2仅在表皮和脂肪体中表达。58 ku EgSCPx蛋白在4龄和5龄灰茶尺蠖的幼虫中肠大量表达,在蛹期少量表达,在成虫期几乎不表达。【结论】纯化获得了EgSCP2重组蛋白,其最优表达条件为温度28℃、IPTG终浓度1.0 mmol/L;制备了高效价的灰茶尺蠖EgSCP2多克隆抗体,明确了灰茶尺蠖EgSCPx蛋白在不同组织中的表达规律。

为探究TaTLP8类甜蛋白在小麦抵御叶锈菌侵染过程中的功能，以小麦近等基因系TcLr26及其轮回亲本Thatcher(Tc)为材料，分别与叶锈菌生理小种260组成不亲和与亲和组合。经生物信息学分析、原核表达、亲和层析、动物免疫，制备了TaTLP8的兔源多克隆抗体，并使用制备的抗体，对小麦与叶锈菌互作的不亲和与亲和组合中TaTLP8的表达情况进行了分析。结果表明，小麦TaTLP8与大麦HvTLP8同源性较高且N-端含有信号肽。以无信号肽区段的TaTLP8基因(TaTLP8-nosp)构建重组质粒pET28a-TaTLP8-nosp,并以0.100 mmol/L的最适浓度IPTG对该蛋白在大肠杆菌BL21中进行诱导表达。以纯化后的TaTLP8-nosp重组蛋白免疫新西兰兔制备了抗体。Western Blotting检测发现，该抗体可与小麦中TaTLP8蛋白特异性结合。使用制备的抗体检测了小麦-叶锈菌不同亲和性组合中TaTLP8的表达水平，发现TaTLP8在不亲和组合中自接种叶锈菌8 h后启动表达，其表达量逐渐升高；在亲和组合中，直至叶锈菌接种后48 h才检测到TaTLP8的蛋白信号，并且其表达水平逐渐下降。总体而言，TaTLP8在不亲和组合中的表达水平高于亲和组合，说明TaTLP8在小麦抵御叶锈菌侵染的过程中可能发挥正调控作用。