【目的】体外真核表达飞蝗(Locusta migratoria)几丁质脱乙酰基酶1和2(chitin deacetylase 1and 2,LmCDA1和LmCDA2)并测定其酶活性,为进一步明确飞蝗LmCDA1和LmCDA2在几丁质降解途径中的生理功能及研发新型绿色环保杀虫剂提供依据。【方法】使用BLASTP和SMART软件在线预测LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的结构域;PCR克隆获得目的基因LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的全长序列,并分别构建p Fast Bac-LmCDA

【目的】几丁质脱乙酰基酶(chitin deacetylase,CDA)是昆虫几丁质代谢系统的重要酶系,研究飞蝗(Locusta migratoria)几丁质脱乙酰基酶基因的分子特性和生物学功能,为新型农药靶标筛选提供科学依据。【方法】基于飞蝗转录组数据库,获得几丁质脱乙酰基酶基因的c DNA序列,将其与飞蝗基因组进行比对,绘制基因结构图。将其与赤拟谷盗CDAs序列进行比对,并采用Blast P和SMART软件进行功能域预测。将已鉴定的飞蝗CDAs分别与赤拟谷盗、果蝇、冈比亚按蚊、家蚕、中华稻蝗和云杉卷叶

利用Trizol法从尖音库蚊中提取总RNA,构建cDNA文库,并克隆出乙酰胆碱酯酶外显子序列;利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对蚊虫乙酰胆碱酯酶进行真核表达,并利用Ni-琼脂糖对酶进行纯化。采用SDS-PAGE对纯化产物进行检测,结果表明得到了纯度较高的乙酰胆碱酯酶。参照Ellman法对酶的活性进行测定,结果显示纯酶的活力为2.219×10-4 mol/(min.g)。

【目的】研究中华稻蝗(Oxya chinensis)几丁质脱乙酰基酶(chitin deacetylase,CDA)基因的分子特性和生物学功能,为新型农药靶标筛选提供科学依据。【方法】采用生物信息学方法在稻蝗转录组数据库中搜索获得几丁质脱乙酰基酶基因cDNA序列,对其进行保守区域分析,选取赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、果蝇(Drosophila melanogaster)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、家蚕(Bombyx mori)和云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)等昆虫物种的同源序列与中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶氨基酸序列进...

［目的］通过表达载体ｐ ＥＴ－２８ａ（＋）在大肠杆菌中克隆表达蜜蜂螺原体ＳｐｉｒｏｐｌａＳｍａ ｍＥｌｌｉｆＥｒｕｍ ＣＨ－１中可能与致病相关的几丁质脱乙酰酶（ＣＨｉＴｉｎ ｄＥａＣＥＴｙｌａＳＥ，Ｃｄａ）基因ＣＨｉｄ，并测定其部分酶学性质，为进一步研究该基因在蜜蜂螺原体致病过程中的作用奠定基础。［方法］利用ｏｖＥｒｌａｐ ＥｘＴＥｎＳｉｏｎ ｐＣｒ（ｏＥ－ｐＣｒ）定点突变技术，在引物设计时插入目的突变，通过３次ｐＣｒ获得突变后的目的片段，测序验证后构建重组质粒ｐ ＥＴＣＨｉｄ，挑取ＢｌＣＨｉｄ表达菌株。ｉｐＴＧ诱导表达目的蛋白，ｎＴａ－ｎｉ２＋柱纯化，ＷＥＳＴＥｒｎ ＢｌｏＴＴｉｎＧ验证，紫．．．

【目的】几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)是昆虫几丁质合成过程中的关键酶之一,由于高等动物不存在该酶,而被认为是设计安全高效杀虫剂的潜在靶标。论文在已克隆得到飞蝗几丁质合成酶2基因cDNA序列(LmCHS2,GenBank登录号:GU067731)的基础上,进一步深入探讨该基因在不同发育时期的表达特性、功能及调控,为基于RNA干扰技术的飞蝗有效控制提供科学依据。【方法】根据已知LmCHS2基因核苷酸序列,设计特异性表达引物,运用RT—qPCR技术研究该基因在卵、若虫及成虫期的表达特性;体外合成LmCHS2的dsRNA后,分别注射至成虫期第1天的雌虫和雄虫,收集第5天的中肠样...

【目的】研究东亚飞蝗几丁质酶家族基因的时空表达特性及其在蜕皮发育中的生物学功能,筛选在飞蝗发育过程中致死性的几丁质酶基因,为实现基于RNAi的飞蝗有效控制提供重要的基础数据。【方法】在东亚飞蝗EST数据库搜索几丁质酶基因片段,用生物信息学方法分析所获得的基因片段序列;以飞蝗不同龄期第4天若虫和5龄东亚飞蝗不同组织部位为材料提取RNA并反转录为cDNA,应用RT-PCR方法研究时空表达特性;选取在表皮高表达的几丁质酶基因LmCht6,采用RNA干扰方法研究其生物学功能。【结果】基于东亚飞蝗EST库搜索和进一步的序列分析,共获得7条几丁质酶基因片段;不同组织部位与不同龄期RT-PCR结果表明这7条...

在构建好蜡梅花cDNA文库并进行EST分析基础上,通过随机克隆测序,得到1个蜡梅几丁质酶的cDNA基因,命名为Cpchia(GenBank登录号:FJ749130)。CpchiacDNA全长为1184bp,开放阅读框为954bp,编码317个氨基酸,其结构包括信号肽、几丁质结合域、可变交联区、催化区,无C端延伸区,为ClassⅠb型胞外几丁质酶,属于几丁质酶第19家族。将Cpchia克隆到原核表达载体pET-28a(+),在大肠杆菌BL2l细胞中以包涵体形式表达融合蛋白,利用透析法获得复性蛋白,其几丁质酶活性经DNS法检测达到200U.mL-1。酶活性和稳定性分析表明,试验条件下,pH7.0有...

油菜叶片经油菜菌核病菌 （ Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ ） 或水溶性壳聚糖处理后， 几丁质酶活性明显提高， 分别在处理后 １ ｄ 和 ２ ｄ 达活性高峰， 比对照分别高５ 倍和２ 倍左右。被激发提高的几丁质酶表现为内切酶活性， 细胞间的几丁质酶比活力显著高于细胞内的酶比活力。菌核病菌侵染后的油菜叶片提取液经６０％ 饱和度的硫酸铵沉淀，再通过再生几丁质柱亲和层析得到了纯化的几丁质酶， 经 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 显示单一的谱带， 其相对分子质量为 ３２ ０００。纯化的油菜叶片几丁质酶能降解油菜菌核病菌菌丝细胞壁， 在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上可抑制菌丝生长。

【目的】通过制备飞蝗(Locusta migratoria)几丁质酶5-1(LmCht5-1)的多克隆抗体,建立飞蝗体内LmCht5-1蛋白水平检测方法,分析LmCht5-1在4龄飞蝗的表达特性及组织定位。【方法】采用MEGA软件对LmCht5-1和LmCht5-2氨基酸序列进行比对,利用Expression网站对LmCht5-1氨基酸序列进行抗原表位预测分析,获得LmCht5-1抗原结构区域;以飞蝗c DNA为模板,通过PCR扩增LmCht5-1的抗原片段;同时通过酶切连接构建含有鸡血清白蛋白OVA的载体p ET32a-OVA;然后通过酶切连接将LmCht5-1插入到p ET32a-OVA载体构建p ET32a-OVA-LmCht5-1;将p ET32a-OVA-LmCht5-1转入表达菌株BL21(DE3)中,IPTG诱导表达重组蛋白OVA-LmCht5-1;利用Ni-NTA纯化后免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。通过ELISA方法检测抗体效价;利用Western blot检测抗体特异性。提取4龄飞蝗不同日龄表皮,采用Western blot分析LmCht5-1蛋白表达模式。对4龄飞蝗注射ds LmCht5-1,检测蛋白水平LmCht5-1表达量,并通过免疫组化方法对LmCht5-1进行定位及功能分析。【结果】通过LmCht5-1和LmCht5-2序列比对和抗原表位预测分析,获得LmCht5-1的471—533AA可作为抗原区域;通过酶切连接分别获得p ET32a-OVA和p ET32a-OVA-LmCht5-1。经诱导表达和纯化后获得重组蛋白OVA-LmCht5-1,分子量为71.34 k D;免疫后制备多克隆抗体OVA-LmCht5-1,ELISA检测效价为1﹕102 400。多克隆抗体OVA-LmCht5-1用于Western blot检测时可特异性识别LmCht5-1,与LmCht5-2蛋白无交叉反应。利用Western blot方法检测4龄若虫各日龄表皮中LmCht5-1蛋白的表达,发现LmCht5-1蛋白随发育日龄其表达量逐渐增加,在蜕皮当天达到峰值,蜕皮后快速降至最低点。对飞蝗若虫N4D2注射ds LmCht5-1,检测到在N4D5时,LmCht5-1的转录水平和蛋白水平均被显著抑制,抑制率分别为70.0%和73.6%。选取注射ds LmCht5-1和ds GFP的4龄飞蝗表皮,进行免疫组化实验显示LmCht5-1定位于表皮细胞和旧表皮中,其功能失活引起旧表皮中几丁质不降解。【结论】获得飞蝗LmCht5-1多克隆抗体可特异性识别LmCht5-1,可用于Western blot和免疫组化检测。明确LmCht5-1在飞蝗4龄若虫蜕皮当天表达最高,定位于表皮细胞和旧表皮中。ds LmCht5-1可减少表皮细胞和旧表皮中LmCht5-1的表达,阻碍旧表皮中几丁质的降解。

【目的】β－Ｎ－乙酰氨基葡萄糖苷酶（β－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉＮｉｄａｓｅ，Ｎａｇ）是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类。研究旨在利用Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ杆状病毒表达系统获得高纯度ｌｍＮａｇ１蛋白并对其酶学特性进行分析，探究该酶在飞蝗（ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）生长发育过程中的生物学功能，为飞蝗绿色防控分子靶标研发提供理论与实践依据。【方法】根据ｌｍ Ｎａｇ１的ｃｄＮａ全长序列（ｇｅＮ ＢａＮｋ：ＪＸ８８８７２０．１）设计包含酶切位点Ｂａｍ Ｈ Ⅰ、ＨｉＮｄ Ⅲ和６×Ｈｉｓ标签的引物。采用Ｐｃｒ技术扩增包含开放阅读框的目标片段，双酶切后连接至ＰＦａｓｔ Ｂａｃ～（ｔｍ）－ｄ．．．

采用快速扩增cDNA末端(RACE)克隆技术,通过设计甲壳素脱乙酰酶简并引物,从总状毛霉(Mucor racemosus)菌丝体中克隆了CDA2的基因(EF468349)及其全长cDNA(DQ678929)序列。与已获得的总状毛霉菌cda1基因相比,cda2基因中不含内含子。总状毛霉cda2全长cDNA为1 378 bp,包含23 bp 5’端非翻译区、1 254 bp开放阅读框和101 bp 3’端非翻译区,编码一条由418个氨基酸残基组成的多肽链,其N端包含一段21个氨基酸残基组成的信号肽,在150～272氨基酸残基区存在一个多糖脱乙酰酶保守结构域。通过构建pET28a-cda2表达载体和...

胸苷酸激酶是d TTP从头合成和补救途径的关键酶,催化d TMP形成d TDP,在DNA复制和生物的生存中发挥着必不可少的作用。本文在前期研究的基础上,对从泡桐丛枝(Pa WB)植原体中获得的的3个同源蛋白TMK-a-1、TMK-a-2及TMK-b与已报道的小麦蓝矮(WBD)、洋葱黄化(OY-W)植原体的TMK-a、TMK-b的氨基酸序列进行了比对和相似性分析,结果显示Pa WBPS TMK-b与WBD TMK-2和OY-W TMK-b之间的相似性分别为95.65%和99.03%;Pa WBPS TMK-a-1与Pa WBPS TMK-a-2的相似性为90.57%,且二者与WBD TMK-1和...

【目的】研究中华稻蝗(Oxya chinensis(Thunberg))几丁质合成酶1(CHS1)基因的表达特性及其在生长发育过程中的作用,从而为实现基于RNAi的蝗虫有效控制提供理论依据。【方法】根据已知中华稻蝗几丁质合成酶1基因(OcCHS1)保守区域部分cDNA序列(GenBank登录号:HM214491)设计特异性表达引物,运用RT-PCR和qPCR研究时空表达特性;采用RNA干扰技术研究其生物学功能。【结果】OcCHS1在中华稻蝗各龄期都有表达,其体表为高表达,其次是气管,其它组织部位表达量低。RNA干扰试验发现,4龄第4天若虫注射OcCHS1的双链RNA(dsRNA)后,与对照组相...

【目的】克隆中国水仙几丁质酶基因,分析其在水仙不同组织中的表达,为提高中国水仙的抗病性提供参考。【方法】利用RT-PCR技术克隆得到中国水仙几丁质酶基因,对其序列及编码氨基酸序列进行生物信息学分析,通过qRT-PCR分析该基因在感染基腐病、病毒病及褐斑病中国水仙根、叶中的表达。【结果】中国水仙几丁质酶基因的cDNA序列长768bp,编码230个氨基酸,其编码蛋白的分子质量为25.4ku,理论等电点为9.04,为不稳定蛋白,亲水性强,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主。该基因编码的蛋白与荷兰芹几丁质酶蛋白的亲缘关系最近,隶属于糖苷水解酶19家族,与溶菌酶相似超家族基因的保守结构域类似,推测其可能是...