【目的】分析飞蝗(Locusta migratoria)内表皮结构糖蛋白(endocuticle structural glycoprotein)基因LmAbd-2的序列特征和表达特性,利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术结合Hematoxylin and eosin(H&E)染色方法以及透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)技术探究其生物学功能,探讨其对飞蝗内表皮发育的影响。【方法】基于课题组飞蝗转录组数据库获得LmAbd-2的cDNA编码序列,并克隆验证。利用ExPASy工具翻译LmAbd-2氨基酸序列,然后利用SignaIP4.1Server和SMART软件分别对其信号肽和结构域进行分析;利用NetOGlyc4.0 Server对其糖基化位点进行预测,使用GENEDOC软件进行多序列比对,并利用MEGA 6.0软件中neighbor-joining(NJ)方法与其他昆虫同源序列进行聚类分析。采用荧光定量PCR(reverse-transcription quantitative PCR,RT-qPCR)分析LmAbd-2在飞蝗5龄第2天不同组织以及4龄(N4D1—N4D6)、5龄(N5D1—N5D8)和成虫(AD1—AD4)表皮不同发育时期表达模式。采用RNAi技术结合H&E染色方法以及TEM技术观察干扰LmAbd-2后对飞蝗生长发育和表皮结构的影响。【结果】序列分析结果显示,飞蝗LmAbd-2 cDNA编码序列长为683 bp,开放阅读框为459 bp,编码152个氨基酸;功能域分析发现LmAbd-2含有1个信号肽和1个几丁质结合域(chitin binding domain 4,ChtBD4),属于CPR家族RR-1亚类;序列比对分析发现其在物种间具有较高的保守性,其中与沙漠蝗(Schistocerca gregaria)SgAbd-2序列相似度为92.5%,且在N末端含有一个保守基序PTPPPIP,其中第2位苏氨酸为糖基化位点;系统发育分析结果显示LmAbd-2与SgAbd-2聚为一支,亲缘关系最近;RT-qPCR分析结果显示LmAbd-2在体壁中高表达,且在蜕皮后(内表皮形成时期)高表达;沉默LmAbd-2后飞蝗没有肉眼可见的表型,但H&E染色结果显示与对照组相比飞蝗表皮层变薄,进一步超微结构分析发现内表皮片层结构减少。【结论】LmAbd-2是一种内表皮结构糖蛋白,属于CPR家族RR-1亚类,其编码基因主要在体壁中高表达,而且在飞蝗4龄、5龄和成虫内表皮形成时期呈周期性表达;RNAi试验表明,LmAbd-2在飞蝗蜕皮过程中参与内表皮的形成。

【目的】基于飞蝗(Locusta migratoria)转录组数据库获得内表皮蛋白(endocuticle structural glycoprotein)基因Lm Abd-5的c DNA序列,分析该基因的序列特征和m RNA表达特性,采用RNAi方法分析其生物学功能,探讨其在飞蝗表皮形成中的作用,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库,获得Lm Abd-5 c DNA全长序列并克隆验证;采用Signal P在线软件分析蛋白的信号肽,利用SMART网站预测其功能域,使用

【目的】基于飞蝗(Locusta migratoria)转录组数据库搜索并克隆获得飞蝗表皮蛋白基因LmNCP1(nymph cuticle protein 1),分析其序列特征和表达特性,通过蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)诱导和干扰20E受体基因LmEcR表达研究其表达调控,并基于RNA干扰(RNAi)方法分析其生物学功能,为阐明该基因在飞蝗表皮发育过程中的作用提供理论依据。【方法】依据飞蝗转录组数据库获得表皮蛋白基因LmNCP1,结合RT-PCR技术克隆获得其全长开放阅读框(O

【目的】获得飞蝗（Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）表皮蛋白ｏｂｓｔｒｕｃｔｏｒ（ｏｂｓｔ）家族基因的ｃ ＤＮａ序列，并研究其序列特征和ｍ ｒＮａ表达特性，探讨其生物学功能，为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库获得ｏｂｓｔ家族基因ｃ ＤＮａ片段，并进行ｂＬａｓｔ分析得到ｏｂｓｔ家族基因的ｃ ＤＮａ序列；采用ｒａｃＥ技术扩增该家族基因的３′ｃ ＤＮａ序列，拼接后获得全长；ｓｉｇＮａＬ Ｐ在线软件分析蛋白的信号肽，ｓｍａｒｔ网站预测其功能域，并使用ｍＥｇａ ５．１０软件中ＮＥｉｇｈｂｏｒ－ＪｏｉＮｉＮｇ方法，与黑腹果蝇（ＤｒｏｓｏＰｈｉＬａ ｍＥＬａＮｏｇ．．．

【目的】获得飞蝗(Locusta migratoria)表皮蛋白Obstructor(Obst)家族基因的c DNA序列,并研究其序列特征和m RNA表达特性,探讨其生物学功能,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库获得Obst家族基因c DNA片段,并进行BLAST分析得到Obst家族基因的c DNA序列;采用RACE技术扩增该家族基因的3′c DNA序列,拼接后获得全长;Signal P在线软件分析蛋白的信号肽,SMART网站预测其功能域,并使用Mega 5.10软件中Neighbor-Joining方法,与黑腹果蝇(Drosophila melanog...

豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）是苜蓿田的重要害虫，严重影响苜蓿的产量和品质。为解析豌豆蚜适应苜蓿的分子机制，本研究检测豌豆蚜取食“猎人河”（感蚜）和“甘农5号”（抗蚜）2个苜蓿品种后6个表皮蛋白基因（ApCP7、ApCP10、ApCP19、ApCP35、ApCP62和ApCP19.8-like）的表达水平，并检测了沉默了2个表皮蛋白基因（ApCP7和ApCP62）的豌豆蚜在“猎人河”苜蓿上的存活率。结果表明，与取食“猎人河”苜蓿相比，取食“甘农5号”苜蓿后，豌豆蚜6个表皮蛋白基因的表达水平在头部中显著下调（P<0.01），而在卵巢显著上调（P<0.01）。在腹部组织中，除表皮蛋白ApCP7基因显著上调（P<0.01）外，其余表达水平均显著下调（P<0.01）；ApCP7、ApCP19、ApCP19.8-like和ApCP62在表皮组织中显著上调（P<0.05）。沉默表皮蛋白基因ApCP7和ApCP62后，豌豆蚜取食“猎人河”苜蓿72h后的存活率均显著降低（P＜0.05），分别为76.67%±0.37%和80.67%±0.58%。据此推测，ApCP7和ApCP62可能在豌豆蚜适应不同抗性水平的苜蓿品种中发挥作用，结果可为解析豌豆蚜与苜蓿的互作关系提供理论依据。

通过对半滑舌鳎（Ｃｙｎｏｇｌｏｓｓｕｓ ｓｅｍｉｌａｅｖｉｓ）进行全基因组及转录组测序，预测了一个半滑舌鳎性别相关基因ＣｓＦＲ２，目前已对该基因进行了克隆和表达分析。为进一步研究ＣｓＦＲ２基因的功能，本研究从蛋白层面入手，构建了原核表达载体ｐ ｅＴ－３２ａ－ＣｓＦＲ２，转化到大肠杆菌ｅ．Ｃｏｌｉ进行诱导表达，用Ｈｉｓ ＴＲａｐ进行蛋白纯化，ｓＤｓ－ｐａｇｅ电泳检测诱导及纯化产物，并将表达纯化的ＣｓＦＲ２蛋白注射１龄半滑舌鳎精巢。由于ＣｓＦＲ２是一个性别相关基因，因此无法通过免疫反应来直接检测其蛋白活性，本研究通过不同时间点取样检测半滑舌鳎其他性别相关基因Ｃｙｐ１９ａ和Ｆｏｘｌ２的表达量变化，来．．．

通过对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)进行全基因组及转录组测序,预测了一个半滑舌鳎性别相关基因CSFR2,目前已对该基因进行了克隆和表达分析。为进一步研究CSFR2基因的功能,本研究从蛋白层面入手,构建了原核表达载体p ET-32a-CSFR2,转化到大肠杆菌E.coli进行诱导表达,用His Trap进行蛋白纯化,SDS-PAGE电泳检测诱导及纯化产物,并将表达纯化的CSFR2蛋白注射1龄半滑舌鳎精巢。由于CSFR2是一个性别相关基因,因此无法通过免疫反应来直接检测其蛋白活性,本研究通过不同时间点取样检测半滑舌鳎其他性别相关基因Cyp19a和Foxl2的表达量变化,来...

为从药物酶的角度建立一种客观评价鱼类"首过效应"的方法,利用荧光定量PCR法测定尼罗罗非鱼(Oreochomis niloticus Linn)肝、肾组织中P-糖蛋白(P-gp)基因表达量,分析了单剂量(40 mg.kg 1)口服给药恩诺沙星(enrofloxacin,ENR)后,尼罗罗非鱼肠道、肝组织中mRNA水平的相对表达量与ENR血药浓度的时实相关性。实验结果显示:在尼罗罗非鱼肠道、肝组织中,P-gp基因在分子量127 bp处出现了与预期大小相符的特异性扩增片段。对尼罗罗非鱼口灌给药ENR后,ENR能迅速通过肠道进入血浆,其在肠道、肝和血浆中的消除速度较快,其药物时量曲线关系符合一级吸收...

【目的】鉴定克隆家蚕组织蛋白酶L基因BmCathepsin L(BmCat L),分析其序列和表达特征。分析家蚕组织蛋白酶L在大肠杆菌诱导下m RNA表达量的变化趋势,为进一步研究家蚕组织蛋白酶L的功能打下基础。【方法】基于家蚕基因组数据库(Silk DB)中序列BGIBMGA006893设计引物,利用RACE技术克隆家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA全长序列,通过在线工具对基因结构和蛋白质分子量及等电点进行预测;在NCBI数据库下载其他物种组织蛋白酶L同源序列,利用Clustalx(1.83)和MEGA 6

为分析甘蔗SUT家族基因新成员的序列特征和基因表达模式,采用cDNA末端快速克隆技术,以甘蔗GT28未成熟茎cDNA为模板克隆蔗糖转运蛋白基因,命名为SoSUT2-h1,GenBank登录号KF808330。该基因的cDNA序列全长为2 132bp,开放阅读框长1 749bp,编码582个氨基酸,预测分子量和等电点分别为61.80ku和6.17。SoSUT2-h1蛋白具有12个跨膜结构。该蛋白具有保守的蔗糖转运蛋白功能域,属于MFS蛋白家族和GPH(蔗糖/H+共转运体)超家族中的一员。荧光定量PCR表明在

为探讨KK-42显著缩短日本沼虾(Macrobrachium nipponense)蜕皮周期的可能机制,本研究采用RACE技术首次从头胸甲中获得了一个含几丁质结合-4(chitin_bind_4)结构域的表皮蛋白(cuticle proteins,CPs)c DNA基因全长,命名为Mn CP-1。该序列全长604 bp,可编码122个氨基酸。氨基酸序列比对显示,Mn CP-1与普通黄道蟹(Cancer pagurus,P81576.1)相似性最高(61%)。系统进化分析发现,Mn CP-1与地中海实蝇(Ceratitis capitata)聚类为一支。Real-time PCR结果显示,头胸甲中Mn CP-1在蜕皮前期晚期(D3-4期)和蜕皮后期(A期)的表达量较高,而在蜕皮间期(C期)和蜕皮前期早期(D0-2期)的表达量较低。KK-42处理能显著上调C期和D0-2期Mn CP-1的表达,在处理后6、24和48 h,其mRNA表达水平较对照组高3倍以上。结果表明,头胸甲上皮细胞Mn CP-1的表达与蜕皮周期有关,KK-42可显著上调C期和D0-2期Mn CP-1的表达。

根据Gen Bank中鲤春病毒血症病毒(SVCV)糖蛋白全基因序列设计特异性引物,以SVCV欧洲株病毒核酸为模板,通过RT-PCR方法获得欧洲株SVCV-G基因,克隆至p PICZαA,构建p PICZαASVCV1540表达质粒。以限制性内切酶Sac I线性化p PICZαASVCV1540后通过化学法转化毕赤酵母感受态细胞X33和GS115,添加1%甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物显示其分子质量为70 ku。Western Blot分析显示该蛋白可以被SVCV山羊多抗识别,表明目的蛋白具有反应原性。

利用RT-PCR技术,将狂犬病病毒株ERA株糖蛋白胞外区基因分两段进行扩增,经克隆与序列分析,两片段大小分别为523,381 bp,各编码174,127个氨基酸,分子量分别为19.7,14.5 kDa。在原核表达载体pET-43a中分别克隆了这两段糖蛋白基因,将重组质粒转化到表达菌BL21(DE3)中,经SDS-PAGE电泳分析,在分子量约为94,89kDa处分别出现新蛋白带,和预期的目的蛋白的分子量相符。两重组蛋白主要以可溶形式表达,利用Ni2+亲和层析柱纯化了蛋白,纯度大于95%。Western-Blot分析结果显示,两种重组融合蛋白均可与兔抗RBV多抗血清反应,具有良好的反应原性。

[目的]本研究旨在构建PCDNA3.1(-)-bPAG1重组表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞细胞中转染表达。[方法]通过基因优化和PCR法扩增得到bPAG1的全基因序列,经T_4连接酶将载体PCDNA3.1(-)与酶切bPAG1片段连接,构建PCDNA3.1(-)-bPAG1重组载体后转染到CHO细胞,经SDS-PAGE和Western Blot检测重组牛妊娠相关糖蛋白1(rbPAG1)的表达效果。[结果]PCR扩增得到1218 bp的bPAG1基因片段,构建的重组质粒PCDNA3.1(-)-bPAG1经双酶切获得约5400和1218 bp的2条片段,与预期相符;对重组载体测序,与优化后的基因序列完全一致;SDS-PAGE和Western Blot鉴定显示,获得相对分子质量约为62 kDa的bPAG1重组蛋白,通过Ni柱亲和层析纯化后,rbPAG1纯度可达88%。[结论]本研究为bPAG抗体的制备和奶牛早孕诊断技术的研发奠定了基础。