PI3K与AKT组成的PI3K-AKT信号通路在细胞的增殖以及凋亡具有重要意义,本试验旨在研究该信号通路在家兔SCs增殖过程中发挥的作用。采用siRNA介导的PIK3CA和AKT3基因进行基因的沉默表达。结果发现对处于对数生长期的细胞转染si-PIK3CA-03或si-AKT3-01后48 h,分别对靶基因和上下游基因PTEN和Fox O1进行qRT-PCR反应,并采用CCK-8试剂盒通过酶标仪检测其在转染si-PIK3CA-03或si-AKT3-01后对细胞增殖能力的影响。结果表明:在转染si-PIK3

【目的】肠炎是家兔最常见且死亡率最高的消化道代谢疾病,给家兔养殖业带来巨大的经济损失。圆小囊作为家兔特有的免疫器官,在家兔肠炎中起重要的调节作用。本试验通过研究家兔圆小囊中microRNAs(miRNAs)的表达差异,探究miRNAs与家兔肠炎发生和调节的分子机制。【方法】本试验以60只新西兰兔为试验样本,采用低纤维饲料(纤维素CF 9%、木质素ADF 13%)诱导家兔非特异性消化道紊乱型肠炎发生,通过临床症状和切片观察将试验样本分为4组(n=9),即健康对照组、诱导健康组、轻微组、严重组;检测家兔圆小囊中miR-130b以及相关炎症因子白介素-22(IL-22)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素-18(IL-18)的表达,通过miRBase、targetscan等预测miR-130b与STAT3的靶向关系,同时利用q PCR检测STAT3的表达量。【结果】圆小囊中,IL-22、TNF-α、IL-18表达量上调,严重组显著高于其他组(P<0.05),miR-130b表达随着炎症程度的加深表达显著下调,2个患病组极显著低于2个健康组(P<0.01);STAT3随着炎症程度加深表达量显著上调,2个患病组极显著高于2个健康组(P<0.01)。【结论】在家兔非特异性消化道紊乱型肠炎发生过程中,圆小囊中的miR-130b通过靶向STAT3参与炎症的发生并发挥作用。

利用RNA干扰在线生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列(其结构特征为正链(19nt)-环(9nt)-负链(19nt))。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体中,构建重组载体pGene-NS3-1,pGene-NS3-2和pGene-NS3-3,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对转化产物进行kan+筛选,碱裂解法提取重组质粒,将酶切鉴定为阳性的质粒测序。结果显示,双链干扰片段克隆方向正确,序列中未出现核苷酸的插入,缺失等突变现象。表明靶向猪瘟病毒NS3基因shR...

【目的】研究3种中草药方剂对家兔精液和精子品质的影响。【方法】选取8～10月龄新西兰雄兔共40只,随机分为A、B、C 3个试验组和1个对照组,每组10只,3个试验组对应饲喂添加A、B、C 3种不同中草药方剂的日粮,剂量均为10g/(只·d),连续用药20d,于用药7d和停药20d后采集家兔精液,检测中草药方剂对家兔精液和精子品质的影响。【结果】用药7d后,试验组家兔的射精量、精子密度和精子活率极显著高于对照组(P<0.01),且A组极显著高于B组和C组(P0.05);试验组家兔的精子顶体完...

为了研究miR-130c-5p在乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus, SHVV)感染中潜在靶基因g的靶向关系以及对病毒复制的影响，本研究以斑点叉尾鮰卵巢(channel catfish ovary, CCO)为实验材料，通过实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)和免疫印迹(Western blot)技术测定SHVV不同感染时间和感染剂量条件下，病毒基因水平和蛋白水平以及miR-130c-5p变化情况。此外，将SHVV的g基因上miR-130c-5p对应的靶序列克隆到质粒pmirGLO，构建质粒pmirGLO-G用于双荧光素酶报告实验进行靶基因验证。结果显示，随着SHVV感染时间及剂量的不断增加，miR-130c-5p和g基因的表达水平都显著上调。进一步实验证明，miR-130c-5p类似物和pmirGLO-G质粒共转染可显著抑制荧光素酶活性强度，而转染miR-130c-5p抑制剂则明显上调了pmirGLO-G报告载体的荧光信号。此外，miR-130c-5p的过表达显著降低了病毒g基因的mRNA及蛋白表达，而抑制miR-130c-5p的表达则上调了g基因的mRNA及蛋白的表达水平。研究结果表明，miR-130c-5p通过靶向SHVV的g基因，引起G蛋白的降解，从而抑制SHVV的增殖。本研究结果为理解microRNA调控SHVV的致病机制提供了重要基础，为抗SHVV疫苗等药物的研发提供了理论支持。

【背景】MicroRNAs(miRNA)是一类小RNA分子（18—23nt），广泛参与了家畜乳腺发育和泌乳性能的调控。项目组前期在小尾寒羊上应用RNA-Seq研究发现，miR-221在空怀期乳腺组织中的表达量是泌乳期的3.6倍，但是尚不清楚miR-221对绵羊乳腺发育的调控机制。【目的】探讨miR-221是否通过靶向基因IRS1抑制绵羊乳腺上皮细胞的活力和增殖数量，为揭示miR-221对绵羊泌乳性能的分子调控机理提供理论参考。【方法】采集小尾寒羊乳腺、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、背最长肌和卵巢等8个组织样本，采用实时荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative PCR,RT-qPCR)技术，构建miR-221在绵羊8个组织中的表达谱。采用细胞转染、CCK-8和Edu等方法，研究miR-221对绵羊乳腺上皮细胞活力和增殖的影响。利用miRDB和miRanda数据库，预测miR-221的靶基因，结合功能富集分析，确定目标靶基因，构建靶基因的野生型和突变型载体，进而用双荧光素酶报告实验，验证miR-221与预测靶基因间的靶向关系。分析过表达和沉默miR-221对靶基因及其信号通路下游功能基因的影响。【结果】RT-qPCR结果表明，miR-221在绵羊乳腺等8个组织中均表达，其中在肺脏和脾脏中的表达量最高，在背最长肌和肾脏中的表达量最低。CCK-8结果表明，miR-221模拟物抑制了绵羊乳腺上皮细胞的活力（P<0.01），而miR-221抑制剂提高了乳腺上皮细胞的活力（P<0.05）。Edu试验发现，miR-221模拟物减少了Edu标记的阳性乳腺上皮细胞数量（P<0.01），而miR-221抑制剂增加了Edu标记的阳性乳腺上皮细胞数量（P<0.01），而miR-221抑制剂提高了该基因的活性（P<0.05），表明IRS1是miR-221的一个靶基因。RT-qPCR结果进一步发现，过表达miR-221降低了绵羊乳腺上皮细胞中IRS1和PIK3R1的表达量（P<0.05），沉默miR-221则提高了这2个基因的表达量（P0.05）。【结论】miR-221通过抑制靶基因IRS1的表达量，最终抑制了绵羊乳腺上皮细胞的活力和增殖数量。

【背景】肌肉系统是维持动物体生存生长的重要基础，在哺乳动物肌肉中，将近一半的肌肉为骨骼肌，骨骼肌通过细胞繁育增殖到迁移融合，逐步形成了具有收缩能力的附着在骨骼上的成熟肌束。在机体内，骨骼肌不仅参与动物生长，也参与呼吸、代谢等生理活动。目前许多研究表明，lncRNA具有调控肌肉生长发育的作用，是影响骨骼肌功能、疾病的关键因子。但由于lncRNA作用机制复杂，方式多样，在物种间保守型很低，故不同种属动物lncRNA之间作用关系不大，且大多数研究存在于人和小鼠等生物体内，而对牛肌肉生长影响的研究内容极少。近年来，人们发现lncRNA会与某些靶基因相互作用，进而调控肌肉细胞的发生过程。【目的】在前期采集不同月龄不同组织部位的牛肌肉，进行高通量测序，获得高表达差异的lncRNA，在对其调控成肌过程进行机制研究的基础上，探究长链非编码RNA lnc721与其靶基因MMP9的互作关系，以及MMP9对牛骨骼肌细胞生长发育的影响，以期为牛骨骼肌发育调控机制的研究提供参考。【方法】前期试验发现干扰lnc721对牛骨骼肌卫星细胞增殖具有正调控作用，且对其分化具有负调控作用。为了进一步探究lnc721对牛肌肉发育的调控通路。分别在牛骨骼肌卫星细胞的分化期设置了3个干扰lnc721牛骨骼肌卫星细胞组，与3个对照组采用NGS技术进行转录组测序，以期获得lnc721差异靶基因，进一步研究lnc721对牛骨骼肌发育的调控通路。根据筛选结果以及qRT-PCR的验证结果，试验选取MMP9作为lnc721的靶基因，并通过CatRAPID网站对lnc721与MMP9结合能力进行预测。设计并合成lnc721及MMP9干扰序列，转染至牛骨骼肌卫星细胞中，通过qRT-PCR、Western blot技术在mRNA水平与蛋白质水平分析下调lnc721对MMP9表达情况的影响。并且通过下调MMP9，采用qRT-PCR、Western blot与EdU技术检测增殖标志因子Ki67、Pax7以及分化标志因子MyHC与MyOG的表达情况，以反映下调MMP9对牛骨骼肌卫星细胞生长发育的影响。【结果】CatRAPID结果显示，lnc721与MMP9结合倾向为0.75，共有9个结合位点，二者存在互作结合。干扰lnc721之后，采用qRT-PCR分析，结果表明在细胞增殖期下调lnc721可以极显著抑制MMP9表达（P<0.01），而在分化期则极显著促进MMP9的表达（P<0.01），证实了MMP9为lnc721调控牛骨骼肌卫星细胞互作的靶基因。进而下调MMP9，检测对增殖期细胞的影响，发现Ki67的mRNA水平表达极显著上调（P<0.01）,Pax7蛋白表达量显著上调（P<0.05）,EdU观察下调MMP9后的阳性细胞率也明显升高。同样检测下调MMP9之后对细胞分化期的影响，发现下调MMP9后镜下观察发现下调MMP9会抑制肌管形成，同时MyHC的mRNA和蛋白表达量极显著下降(P<0.01), MyoG蛋白表达量显著下调(P<0.05)。【结论】lnc721与MMP9相互结合。在细胞增殖期干扰lnc721极显著抑制MMP9表达，而在分化期促进MMP9的表达，且干扰MMP9可促进细胞增殖并抑制分化。证明lnc721靶向MMP9调控牛骨骼肌卫星细胞的发育。

【目的】探明miR-7与CTSK基因相互作用关系及其对贵州黑山羊卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响，为贵州黑山羊优良品种保藏、选育与开发利用提供依据。【方法】采用在线数据库筛选miR-7与CTSK基因3＇UTR的结合靶点，通过将CTSK基因3＇UTR插入双荧光素酶报告系统中进行互作位点检测；采用CCK-8和划痕试验检测miR-7是否靶向调控CTSK基因影响贵州黑山羊卵巢颗粒细胞的增殖和迁移；过表达miR-7后采用RT-qPCR检测其对促增殖蛋白PCNA、抗凋亡蛋白BCL2和促凋亡相关蛋白BAX、caspase-3、caspase-9表达水平的影响。【结果】成功构建CTSK基因3＇-UTR 2个预测靶点的野生型和突变型双荧光素酶报告载体；双荧光素酶试验结果表明CTSK基因3＇UTR区的2个预测靶位点均受miR-7调控；CCK-8和细胞划痕结果表明：转染miR-7试验组的卵巢颗粒细胞增殖和迁移能力均显著高于对照(NC)组；RT-qPCR结果表明：上调miR-7能极显著上调PCNA和BCL2的表达，抑制BAX、caspase-3和caspase-9的表达。【结论】miR-7可以靶向结合CTSK的3＇UTR区2个靶位点并极显著抑制CTSK基因的表达；过表达miR-7可以显著促进贵州黑山羊卵巢颗粒细胞增殖和迁移能力，并促进增殖标志基因、抗凋亡基因的表达和抑制促凋亡相关基因的表达。研究结果可为进一步研究miR-7靶向调控CTSK表达影响贵州黑山羊繁殖性能的分子机制提供理论依据。

探讨低温胁迫下,干扰生长抑制特异性基因2(Gas2)对罗非鱼肾脏细胞系增殖和凋亡的影响。采用脂质体转染法介导Gas2短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)及阴性对照短发夹RNA处理罗非鱼肾脏细胞,24 h后,以5℃/d降温速率对转染后的罗非鱼肾脏细胞进行低温胁迫,分别在25、20、15、10℃进行细胞采集。随后,利用实时荧光定量PCR检测Gas2基因及P53基因mRNA表达变化,利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并开展WST-1细胞增殖实验检测细胞的增殖情况。结果表明,低温胁迫下,阴性对照组及Gas2干扰组中Gas2和P53基因mRNA的表达在15℃和10℃时均显著升高;Gas2干扰组中Gas2和P53基因mRNA的表达水平在所有温度下均显著低于阴性对照组;随着温度降低,阴性对照组及Gas2干扰组的细胞凋亡率均明显升高,但Gas2干扰组的细胞凋亡率明显低于阴性对照组;低温胁迫下,对照组及Gas2干扰组的细胞增殖率与25℃时相比均显著下降;当温度降至15℃时,Gas2干扰组的细胞增殖率显著高于对照组。罗非鱼肾脏细胞在受低温胁迫时,抑制Gas2基因能够降低P53基因mRNA的表达水平以及细胞的凋亡率,并增加细胞的增殖。

利用短发夹RNA(shRNA)介导的RNA干扰技术构建3种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)亚型基因(Akt1、Akt2、Akt3)敲低的小鼠胚胎干细胞(mESC)系，通过CCK–8法检测细胞活力；反转录荧光定量聚合酶链式反应(qRT–PCR)检测分化相关基因的表达；蛋白质印迹法(WB)检测多能性和分化相关蛋白的表达，研究Akt亚型基因敲低对mESC更新及分化的影响。结果表明：Akt1和Akt2的基因敲低不影响mESC的增殖和分化，但会抑制拟胚体(EB)内胚层和中胚层的形成；Akt2的基因敲低促进EB中后期外胚层的形成；Akt3的基因敲低会减缓mESC的增殖，但不影响多能性蛋白的表达，促进拟胚体中胚层和外胚层的形成。

利用短发夹RNA(shRNA)介导的RNA干扰技术构建3种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)亚型基因(Akt1、Akt2、Akt3)敲低的小鼠胚胎干细胞(mESC)系，通过CCK–8法检测细胞活力；反转录荧光定量聚合酶链式反应(qRT–PCR)检测分化相关基因的表达；蛋白质印迹法(WB)检测多能性和分化相关蛋白的表达，研究Akt亚型基因敲低对mESC更新及分化的影响。结果表明：Akt1和Akt2的基因敲低不影响mESC的增殖和分化，但会抑制拟胚体(EB)内胚层和中胚层的形成；Akt2的基因敲低促进EB中后期外胚层的形成；Akt3的基因敲低会减缓mESC的增殖，但不影响多能性蛋白的表达，促进拟胚体中胚层和外胚层的形成。

[目的]研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对家蚕卵巢细胞系(Bm N)细胞cyclin A基因表达及细胞周期的影响。[方法]通过脂质体转染试剂将针对cyclin A基因的特异性siRNA片段转入家蚕Bm N细胞,采用SYBR荧光定量PCR法检测cyclin A mRNA的表达,流式细胞技术检测细胞周期变化。[结果]转染siRNA-cyclin A可有效下调cyclin A基因的表达,转染48 h后,cyclin A mRNA表达量降低到对照的37.4%;流式细胞仪分析表明:与对照组相比,转染组G0/G1期细胞比例显著增加,细胞周期阻滞于G1期。[结论]靶...

[目的]研究小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）对家蚕卵巢细胞系（BmN）细胞 cyclinA基因表达及细胞周期的影响。[方法] 通过脂质体转染试剂将针对 cyclinA 基因的特异性 siRNA 片段转入家蚕 BmN 细胞，采用 SYBR 荧光定量 PCR 法检测 cyclinA mRNA 的表达，流式细胞技术检测细胞周期变化。[结果]转染 siRNA-cyclinA 可有效下调 cyclinA 基因的表达，转染 48 h 后，cyclinA mRNA 表达量降低到对照的 37.4%；流式细胞仪分析表明，与对照组相比，转染组 G0/G1期细胞比率显著增加，...

【目的】旨在证明miR-222可促进家兔骨骼肌卫星细胞增殖。【方法】利用实时荧光定量(RT-qPCR)法检测miR-222在初生新西兰兔各组织中的表达量;利用targetscan、miRbase等生物信息学软件预测miR-222的靶基因;对靶基因进行KEGG通路分析和GO分析,进而预测miR-222是否参与调控骨骼肌卫星细胞增殖;体外培养的骨骼肌卫星细胞转染miR-222过表达和抑制表达载体,利用CCK-8实验和EdU染色实验检测72、96和120 h细胞的增殖情况。【结果】miR-222在各组织中差异表达,且在肝脏中的表达量最高,回肠中的表达量最低;预测得到的靶基因富集到MAPK、PI3K-AKT等多个参与骨骼肌卫星细胞增殖的重要信号通路; CCK-8实验和EdU染色鉴定发现,过表达miR-222能促进骨骼肌卫星细胞增殖,miR-222抑制表达抑制骨骼肌卫星增殖。【结论】miR-222能够促进家兔骨骼肌卫星细胞的增殖。

【目的】通过理论预测与试验验证,旨在揭示miR-433-3p对BCKDHB的调节机制。【方法】利用Target Scan、miRanda和DIANA-micro T 3个在线软件,以BCKDHB的序列预测与BCKDHB有靶标关系的相关miRNAs。为了验证理论上的预测结果,用设计好的BCKDHB 3′-UTR的特异性引物进行PCR扩增,得到目的片段并进行割胶回收和纯化,并将Pmir-GLO与目的片段同时使用Xho Ⅰ和Xba Ⅰ两个限制性内切酶进行双酶切,再用T4连接酶连接双酶切之后的目的片段和Pmir-