基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术是一种新兴的分子修饰工具,可实现基因组特定位点碱基的缺失、插入或替换,造成基因功能丧失,现已广泛应用于基因功能的研究。为深入探讨甘蓝型油菜中Bn SVP的生物学功能,以中双11号基因组(甘蓝型油菜参考基因组,v4.1)中的4个Bn SVP为靶标基因,并针对不同染色体上的Bn SVP基因,应用CRISPR-P 2.0软件共设计了12条特异sg RNA种子序列,以实现4个Bn SVP同源基因的全部或部分敲除;以p YLCRISPR-Cas9P35S-H为基本载体,以At U3b或At U3d为sg RNA转录启动子,采用Golden gate cloning技术分别组装构建了6个双靶点CRISPR/Cas9植物表达载体。测序结果表明,6个CRISPR/Cas9植物表达载体各sg RNA表达盒DNA序列正确,双靶点组装顺序无误。研究结果为进一步原生质体瞬时表达和农杆菌介导的油菜遗传转化奠定了基础,同时也为应用CRISPR/Cas9基因组编辑系统研究植物多拷贝同源基因的功能提供参考。

[目的] 本文旨在利用基因编辑技术，降低水稻直链淀粉含量，改善稻米食味品质特性，以培育直链淀粉含量降低的优质育种材料。[方法] 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，下调水稻品种‘宁粳4号’淀粉合酶基因（SSSIIb）的表达，对转基因家系进行目标基因的分子鉴定和主要农艺性状、生理生化指标的测定，选出目标育种材料。[结果] 对淀粉合酶基因SSSIIb进行多靶位点编辑，得到3个目标基因敲除的转基因家系，分别为SSS2-Q、SSS2-Z和SSS2-H家系。与‘宁粳4号’相比，SSS2-Q家系直链淀粉含量显著下降，支链淀粉链长分布呈现中等链长减少，而胶稠度和热浆黏度、冷浆黏度等指标均优于‘宁粳4号’，品质指标达到预期目标，但每穗实粒数和结实率降低，粒长增加。而在SSS2-Z与SSS2-H家系中，品质指标没有实现预期目标。RT-qPCR分析发现，SSS2-Q家系中SSSIIb基因表达下调，其他淀粉合成相关基因表达出现变化。[结论] 通过CRISPR/Cas9技术，靶向编辑了‘宁粳4号’中SSSIIb基因，降低了SSS2-Q家系直链淀粉含量，品质指标得到改善，为优质食味转基因水稻新品种培育提供新种质。

【目的】易落粒既不利于稻谷收获,也不适宜于水稻机械化生产。利用现阶段前沿的分子育种手段——CRISPR/Cas9技术对水稻落粒性主效基因qSH1进行定点编辑,并调查分析易落粒性状的改良效果,为创制稳产和适合机械化生产的水稻新种质奠定材料基础和探索新途径。【方法】以qSH1为靶标基因,根据CRISPR/Cas9技术原理设计靶标位点。将所设计的靶点序列在水稻参考基因组中比对分析以排除非特异性靶位点,最终筛选出qSH1-T1和qSH1-T5靶标位点。化学合成靶位点寡核苷酸序列,退火后分别与pYLg RNA-U3、pYLg RNA-U6a载体连接构建U3-qSH1T5-g RNA、U6a-qSH1T1-g RNA表达盒,最后将2个g RNA表达盒同时连接至pYLCRISPR/Cas9表达载体中,构建pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51表达载体。利用农杆菌介导转化易落粒的籼稻品种HR1128,以潮霉素抗性为筛选标记筛选获得T0代转基因阳性植株。利用靶位点扩增测序法判断T0代转基因植株在预期靶标位点是否发生突变,并进一步分析突变类型及基因型。将靶点序列在水稻参考基因组中比对,选择与靶点序列匹配度大于或等于15 bp且3′端具有NGG的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估。利用潮霉素基因及靶点检测进一步筛选无T-DNA成分的qsh1突变植株并进一步构建qsh1突变系,并分析qsh1突变系的落粒性、qSH1的表达量及预测编码氨基酸序列。【结果】pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51载体成功地实现了对qSH1靶标位点的定点编辑。在T0代转基因阳性植株中获得7个突变单株,其中qSH1-T1和qSH1-T5靶点的突变频率分别为54.55%和63.64%,突变基因型包括纯合突变、杂合突变、双等位突变和嵌合突变,突变类型包括碱基插入、碱基缺失及碱基突变。通过对T1代植株进行潮霉素基因筛选、靶位点扩增测序,结果表明,在T1代植株中Cas9载体骨架和qSH1突变位点都发生了分离,获得2种不含T-DNA成分的qsh1纯合突变株,并以此构建2个T2代qsh1纯合突变系群体(17SZ01和17SZ02)。对46株转基因阳性植株进行脱靶效应分析,发现3个潜在脱靶位点均未发生突变,表明所设计的靶标位点具有较高的特异性。通过落粒性测定分析表明,与野生型对照相比,2个qsh1纯合突变系的落粒性显著降低。进一步分析发现,2个突变系氨基酸翻译均发生改变并提前终止,同时17SZ01突变系qSH1的表达量显著降低。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对水稻基因组进行定点编辑定向改良水稻品种落粒性,是一条高效、安全的分子改良育种策略。

CRISPR/Cas9系统作为新一代基因组编辑技术,一经问世就受到广泛关注。CRISPR/Cas9系统具有对特定基因位点进行精确修饰(包括敲除、插入、替换等)的强大功能,同时具有操作简单、效率高、适应性广等技术优势,目前已在微生物、植物、动物以及人类基因治疗等整个生命科学领域得到应用。本文简要介绍了CRISPR/Cas9技术的发展历程、作用机理、技术优势、功能及应用领域,总结该技术在植物领域的基因组定向编辑中的研究进展。并提出了这项技术在草类植物基因功能分析、基因代谢调控途径与遗传改良等方面的应用前景,为

当外源ＤＮＡ通过转基因技术导入植物细胞后，会以同源重组或非同源重组两种不同的方式整合到基因组中，进而获得相应的目标性状。外源ＤＮＡ与受体细胞序列相同或相近的位点发生重新组合，从而整合到受体细胞的染色体上称之为同源重组；当发生了ＤＮＡ双链断裂的细胞为了避免ＤＮＡ或染色体断裂而造成ＤＮＡ降解或对生命力的影响，而强行将２个ＤＮＡ断端彼此连接在一起时则为非同源重组。发生非同源重组的细胞其基因组常出现核苷酸片段的插入和／或缺失以及其他突变等多种情况，使得研究者无法得到精确控制的突变结果；而发生同源重组的细胞基因组序列通常不变，通过加入同源重组的供体ＤＮＡ，可以实现对基因组的精确修饰和改造。由于在植物中产．．．

当外源DNA通过转基因技术导入植物细胞后,会以同源重组或非同源重组两种不同的方式整合到基因组中,进而获得相应的目标性状。外源DNA与受体细胞序列相同或相近的位点发生重新组合,从而整合到受体细胞的染色体上称之为同源重组;当发生了DNA双链断裂的细胞为了避免DNA或染色体断裂而造成DNA降解或对生命力的影响,而强行将2个DNA断端彼此连接在一起时则为非同源重组。发生非同源重组的细胞其基因组常出现核苷酸片段的插入和/或缺失以及其他突变等多种情况,使得研究者无法得到精确控制的突变结果;而发生同源重组的细胞基因组序列通常不变,通过加入同源重组的供体DNA,可以实现对基因组的精确修饰和改造。由于在植物中产...

基于Golden Gate载体构建过程,对CRISPR/Cas9双靶点敲除技术的载体构建系统进行了优化,建立了一种简单快速高效且无PCR扩增的双靶点CRISPR/Cas9载体构建方法。在本方法中,只需将设计好的2个靶点DNA小片段和1个外源片段用T4DNA连接酶构建到CRISPR/Cas9载体上即可。用本方法对10个已报道的水稻基因构建了20个双靶点CRISPR/Cas9载体,阳性率为100%,测序结果显示无突变。该载体系统非常适合大批量CRISPR/Cas9载体的构建,同时也为其他植物中构建双靶点CRISPR/Cas9载体提供借鉴。

为探明miRNA在红麻中的功能,以红麻基因组DNA为模板,根据红麻microRNA(miRNA)高通量测序数据结果,克隆红麻miR394前体基因序列,并构建CRISPR/Cas9载体。结果表明红麻miR394前体基因序列大小为175bp,用Mfold在线软件分析,其前体序列能形成稳定的二级结构。根据红麻miR394前体基因序列,设计合适的CRISPR/Cas9靶标序列,利用改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,以AtU3b和AtU6-29质粒为模板,使用Overlapping PCR法构建AtU3b-sgRNA和AtU6-29-sgRNA表达盒,使用Golden Gate Cloning方法成功把靶标AtU3b-sgRNA和AtU6-29-sgRNA表达盒构建到pYLCRISPR/Cas9载体中,并将构建好的载体命名为pCas9-miR394。分离红麻叶片原生质体,将pCas9-miR394载体转入红麻叶片原生质体中进行瞬时表达,测序结果表明:2个靶点Target site 1(T1)和Target site 2(T2)处都发生碱基突变,表明pCas9-miR394载体在红麻原生质体中具有靶向切割的活性。

ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ９系统是近年发展起来的、由导向ＲＮａ介导的基因组定向编辑技术。总结了ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ９基因组定向编辑技术的发展历程，并综述了其在作物遗传育种研究中的多方面应用。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ系统是存在于大多数细菌与所有古生菌中的一种后天免疫系统，以消灭外来质体或者噬菌体。根据ＣａＳ蛋白组分及氨基酸序列不同，已发现的ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ系统可以分为３种不同类型，Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中，Ⅱ型是以ＣａＳ９蛋白及导向ＲＮａ为核心组份，组成较为简单，是目前经过改造用于开发基因组定向编辑技术的主要类型。自ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ９技术体系首先在人类与动物细胞系中建立后，经过改造的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ．．．

以甘蓝型油菜‘湘油15号’为试材,通过生物信息学分析,运用CRISPR/Cas9系统对Bna SDG8第1个外显子上的Bna SDG8–A和Bna SDG8–C保守序列区域进行CRISPR/Cas9敲除位点设计,构建了CRISPR/Cas9敲除载体p CAMBIA1300–sg RNA/Cas9–Bna SDG8;通过遗传转化,获得转化植株19株;经测序比对,4株植株的Bna SDG8被成功编辑;通过对定向敲除植株开花时间的统计分析,初步确定Bna SDG8参与甘蓝型油菜开花时间的调控。

【目的】克隆山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因（CASase）DNA全长序列，构建CRISPR/Cas9敲除载体，为筛选“低毒、高硫”山黧豆品系奠定基础。【方法】以萌发4 d山黧豆幼苗根部为材料，提取其基因组DNA，利用PCR克隆CASase基因全长；经序列同源性、内含子、外显子、sgRNA靶位点和脱靶分析后，在CASase cDNA上选取5个sgRNA靶位点进行寡核苷酸链设计和体外活性检测；从5个sgRNA靶位点中取活性较高的4个sgRNA，利用酶切连接法构建基因敲除载体pPLHACas9-sgRNA20r

为了研究本氏烟草NbEHD1基因的生物学功能，采用生物信息学方法对其基因结构、蛋白保守结构域、磷酸化位点、亚细胞定位及进化关系等多个方面进行预测。结果表明，本氏烟草NbEHD1编码序列全长1 638 bp,其基因组序列包含16个外显子和15个内含子。NbEHD1蛋白大概率定位于细胞质中，无信号肽，无跨膜区，蛋白序列有42个磷酸化位点。NbEHD1属于P-loop＿NTPase超家族，具有EHD家族特有保守结构域。系统进化关系结果表明，本氏烟草NbEHD1与马铃薯、番茄的EHD序列亲缘关系较近。经与SGN数据库中本氏烟草测序数据比对，获得NbEHD1预测的全序列并设计基因特异性引物，扩增得到其序列全长。在获得NbEHD1 CRISPR/Cas9基因编辑载体后，采用农杆菌介导的方法，将此载体成功转化到本氏烟草叶片，经鉴定成功获得T_0阳性植株16株，为进一步确定NbEHD1基因的生物学功能提供了研究材料。

为明确杜梨赤霉素受体GID1(Gibberellin insensitive dwarf 1)的生物学功能,以杜梨为试材,通过同源克隆方法得到PbGID1s基因,利用生物信息学分析软件构建基因结构并设计靶位点;利用酶切-连接方法将带有靶点的sgRNA表达盒构建至CRISPR/Cas9表达载体上;通过农杆菌介导方法,将CRISPR/Cas9表达载体转化至杜梨子叶中。结果表明,在杜梨基因组中克隆得到4个PbGID1s,分别命名为PbGID1b-1、PbGID1b-2、PbGID1c-1、PbGID1c-2,基因结构分析显示该家族基因均由2个外显子和1个内含子组成;氨基酸序列比对发现PbGID1s均具有GID1家族所特有的HGG和GXSXG保守结构域;将含有5个靶位点的sgRNA表达盒成功构建至pYLCRISPR/Cas9P_(35S)-N植物表达载体上,可同时对该家族4个基因进行编辑;杜梨遗传转化试验结果表明,共计浸染595粒杜梨子叶,获得抗性芽176个,阳性植株33株,转化效率达到5.55%。成功构建了可以同时靶向杜梨PbGID1s家族基因的CRISPR/Cas9载体,通过农杆菌介导,成功将该载体转化至杜梨子叶,并获得阳性植株,为杜梨遗传转化和基因编辑创建矮生突变体研究提供了重要参考。

[目的]本文旨在利用Cas9蛋白/sgRNA体系，提高猪胎儿成纤维细胞的基因组编辑效率，为促进CRISPR/Cas9技术在猪上的广泛应用奠定基础。[方法]针对猪ROSA26位点的启动子区（包含第一外显子区）设计两条sgRNAs，并将其构建在PX459-Cas9-puro质粒上，以获得PX459-Cas9-sgRNA质粒。将sgRNA靶序列连同PAM序列构建在RGS-CR质粒上，以获得RGS-sgRNA质粒。使用PX459-Cas9-sgRNA质粒与RGS-sgRNA质粒系统共转染，筛选切割效率较高的一条sgRNA，并使用该sgRNA对猪胎儿成纤维细胞进行后续打靶实验。分别使用PX459-Cas9-sgRNA质粒和Cas9蛋白/sgRNA两种方法对猪胎儿成纤维细胞的靶位点进行基因敲除，将转染后的细胞提取基因组DNA，桑格尔测序检测打靶效率。[结果]成功构建了打靶猪ROSA26靶序列的PX459-Cas9-sgRNA质粒，及含PAM序列的RGS-sgRNA，且质粒测序结果显示序列插入正确；RGS-sgRNA筛选结果表明，sgRNA2的打靶效率极显著高于sgRNA1 (P < 0.01)，且sgRNA2无脱靶效应，因此后续使用PX459-Cas9-sgRNA2和Cas9蛋白/sgRNA2在猪胎儿成纤维细胞中进行打靶，并比较两者的打靶效率。在猪胎儿成纤维中，PX459-Cas9-sgRNA2质粒的打靶效率为16.67%，Cas9蛋白/sgRNA2体系的打靶效率为33.33%；[结论]Cas9蛋白/sgRNA体系较PX459-Cas9-sgRNA质粒提高了打靶效率约1倍，这对提高后续猪体细胞的基因敲入效率、促进基因编辑在猪上的应用有重要意义。

利用chopchop网站对大鼠Inhba基因的第二外显子设计sgRNA位点，通过合成sgRNA寡核苷酸、酶切连接构建到px330载体，再转染px330–Inhba–sgRNA载体到大鼠L6细胞，通过T7E1酶切、T载体克隆测序来验证sgRNA编辑Inhba基因的效率。结果表明：转染pX330–Inbha–sgRNA载体后，Inhba基因的编辑区域的PCR产物能被T7E1酶切割预期条带；T载体克隆测序显示，随机选取的20个单克隆中有5个克隆在预期切割位点附近出现不同长度的碱基缺失，估测编辑效率为25%。可见，本研究设计的sgRNA能够有效的利用CRISPR/Cas9系统对Inhba基因进行编辑。