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[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
李碗芯 孙莉娜 林向民
当前细菌耐药的形势日益严峻，已引起全世界的广泛关注．革兰氏阴性细菌的耐药性普遍比革兰氏阳性细菌强，这与镶嵌或锚定在革兰氏阴性细菌外膜上的蛋白耐药功能密切相关．目前已知外膜蛋白能够阻碍抗生素通过外膜以及将抗生素排出胞外等方式使细菌产生耐药性，但具体的耐药与调控机制还有待进一步研究．近年来，随着现代科学技术的不断发展，特别是结构生物学、分子生物学与蛋白质组学在该领域的充分运用，有关外膜蛋白功能的研究和技术取得了很大的进步．本文对近年来国内外在细菌外膜蛋白的结构与耐药机理、耐药新功能及新机制等方面的研究进展进行了概述，为揭示革兰氏阴性菌耐药形成机制奠定基础．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
陈瑞花 张辉 唐利燕 孟茹 张豫 王震 李志强 张俊波 陈创夫
【目的】布鲁氏菌外膜蛋白BP26是布鲁氏菌的重要毒力因子,本研究采用bp26基因缺失株和BP26蛋白分别与胚胎滋养层细胞(HPT-8)作用,探讨布鲁氏菌bp26基因的生物学功能。【方法】采用Ni柱亲和层析法纯化BP26蛋白,overlap技术构建布鲁氏菌bp26基因缺失株,用BP26蛋白和bp26基因缺失株分别侵染HPT-8细胞,观察细胞形态变化,ELISA检测上清中的细胞因子。【结果】从布鲁氏菌疫苗株M5-90克隆出bp26基因并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功表达,获得纯化的BP26蛋白,经SDS-PAGE验证正确,Western-Blot鉴定具有免疫原性。将目的片段bp2...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
陈海英 廖富蘋 林健荣
【目的】分离和纯化Paenibacillus polymyxaCP7菌抗革兰氏阴性菌的活性组分,并鉴定其结构。【方法】采用固相萃取柱分离、阳离子交换层析、凝胶过滤层析和HPLC层析等技术对活性组分进行分离纯化,通过紫外-可见光谱、圆二色光谱、红外光谱和MALDI-TOF-TOF-MS质谱对所分离组分进行结构鉴定。【结果】从CP7菌发酵液中分离获得抗革兰氏阴性菌的B、C1和C2组分,分子量分别为1155、1169和1191D。并确定了C1组分的分子式为C53H100O13N16,结构由6个L-α,β-二氨基丁酸(DAB)、2个苏氨酸和2个亮氨酸组成,与多粘菌素E1的结构相同。【结论】从CP7菌发...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
李华 石存斌 钱永华 潘厚军 吴淑勤
采用十二烷基肌氨酸钠法提取哈氏弧菌(Vibrio harveyi)SpGY020601株的外膜蛋白(OMPC),采用酚水法提取溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)EpGS021001株的脂多糖(LPS)。通过碳化二亚铵(EDC)介导的缩合反应,将哈氏弧菌的OMPC与溶藻弧菌的LPS偶联。OMPC-LPS偶联物、未偶联的哈氏弧菌OMPC、溶藻弧菌LPS、哈氏弧菌OMPC和溶藻弧菌LPS的简单混合物以及生理盐水按相同程序免疫卵形鲳(Trachinotus cvatus)。检测血清溶菌酶活性、血清抗体微量凝集反应结果显示,卵型鲳经OMPC-LPS偶联物、OMPC、LPS以及二者的简单...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
李小飞 李槿年 季晶晶 余为一
自行构建的pMD18T-OmpU重组克隆质粒经BamHI/EcoRI双酶切后,定向插入原核表达质粒pGEX-4T-1中构建重组表达质粒pGEX-4T-1-OmpU。将重组表达质粒转化至大肠杆菌E.coliBL21进行IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE电泳及Western-blot分析显示,以包涵体形式表达的GST-OmpU融合蛋白的分子量约为62.9kD,可与鼠抗拟态弧菌外膜蛋白(Omps)免疫血清发生特异性反应,提示重组OmpU保留了天然Omps的抗原性。用纯化的融合蛋白免疫昆明系小鼠,以50LD50拟态弧菌(5×108CFU/mL)攻击,小鼠的免疫保护率为60%(9/15)。表明...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
顾宏伟 陆承平
【目的】本试验以小鼠为动物模型,比较了兔多杀性巴氏杆菌铁调节外膜蛋白(IROMPs)的免疫原性及分析交叉免疫保护效果。【方法】分别以正常培养基和限铁培养基增殖兔多杀性巴氏杆菌C51-12和C51-3,采用Sarcosyl沉淀—超离法提取IROMPs和OMPs,并用SDS-PAGE比较两株之间的差异,同时用正常培养基增殖该菌制备灭活全菌抗原。免疫原性分析,将清洁级小鼠20只随机分成4组,5只/组,以C51-12株的全菌、IROMPs和OMPs作抗原分别免疫,采用间接ELISA检测免疫小鼠的相应抗体动态变化;免疫保护试验,分别采集经4次免疫后小鼠的抗血清,作1﹕10稀释腹腔注射小鼠,每组6只,18...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王丽平 陆承平
为证实国内临床分离的动物源链球菌菌株中是否存在与红霉素耐药性相关的主动外排机制,选取含有mefA基因和ermB基因和不含mefA/ermB基因的链球菌耐药菌株和青霉素、红霉素均敏感菌株,在能量抑制剂氰氯苯腙(CCCP)存在时,采用棋盘法分析红霉素、阿齐霉素、替米考星、青霉素对分离菌MIC的影响,并采用SDS-PAGE电泳分析分离株的膜蛋白图谱。结果显示:CCCP可对含有mefA基因的耐药菌株产生影响,可增强其对红霉素、阿齐霉素的敏感性,但不影响其对替米考星和青霉素的敏感性。含有ermB基因、不含mefA/ermB基因的耐药菌,对红霉素、阿齐霉素、替米考星和青霉素的敏感性不受CCCP的影响。菌株...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘芳园 胡瑞雪 余芳 侯家昊 于子润 顾泽茂
为探究外膜蛋白A(outer membrane protein A,OmpA)对米尔伊丽莎白菌致病作用的影响，以蛙源米尔伊丽莎白菌FL160902为研究对象，通过同源重组法构建OmpA缺失株△ompA，比较缺失株和野生株的生长特性、生物膜形成能力、抗血清杀伤能力、对细胞的黏附能力以及对蛙的致病性差异。结果显示：△ompA的生长能力和抗血清杀伤能力与野生株无显著差异；但与野生株相比，△ompA的生物膜形成能力增加了66%，△ompA对bEnd.3细胞的黏附能力降低了61%；黑斑蛙感染试验显示，△ompA在黑斑蛙血液、脾和脑组织中的载菌量分别为（3.15×10~8±0.09×10~8）、（2.11×10~8±0.07×10~8）和（6.61×10~8±0.16×10~8） copies/g，均显著低于野生株，且△ompA对黑斑蛙的致死率为37%，显著低于野生株的致死率（75%）。上述结果表明，ompA基因缺失不改变米尔伊丽莎白菌的抗血清杀伤能力，但增加了菌株的生物膜形成能力，减弱了菌株的黏附能力，从而降低了该菌对蛙的致病性。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
黄辉 毛芝娟 陈吉刚
根据已发表的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白OmpU的基因序列设计1对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,自哈维氏弧菌致病菌株基因组中扩增获得一段约1 000 bp的序列,构建重组载体pMD18-T-OmpU;测序结果表明,该基因与已发表的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU序列存在98%以上的相似性,该序列在GenBank上的登录号为FJ919231。构建表达质粒pET-30a(+)-OmpU后转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3),在IPTG诱导下实现高效表达,SDS-PAGE显示重组蛋白分子质量约为41 ku,与预期基本相符。重组蛋白以包涵体形式表达。以脲素法得到...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
周丽 刘洪明 战文斌 宋微波
分别用SDS、Sarkosyl及PMSF法分离制备鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、溶藻胶弧菌(Vibrioalginolyticus)主要外膜蛋白(MOMP),通过SDS-PAGE分析比较2种弧菌主要外膜蛋白的组成结构。结果表明,SDS、Sarkosyl和PMSF法分离提取的鳗弧菌和溶藻胶弧菌外膜蛋白中,SDS PAGE电泳图谱不同,鳗弧菌外膜蛋白分子量为27～138kD;溶藻胶弧菌外膜蛋白分子量为27～104kD,其中,45kD、30kD和27kD外膜蛋白为鳗弧菌和溶藻胶弧菌所共有。经比较,Sarkosyl法对2种弧菌外膜蛋白的提取效果较好。对3种方法提取的2种弧菌的主要外膜蛋...
关键词：
鳗弧菌 溶藻胶弧菌 外膜蛋白
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
张伟妮 周丽 邢婧 战文斌
用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)抽提结合超速离心纯化的方法提取了溶藻弧菌SR1、鱼肠道弧菌HQ010223-1和鳗弧菌S010610-1共3株水产动物致病弧菌及其他11株水产动物主要弧菌和4株非弧菌属细菌的外膜蛋白(Outer membrane proteins,OMPs),通过SDS-PAGE分析其外膜蛋白的组成结构。结果表明,3株致病弧菌分别有12、6和6条外膜蛋白带,且分子量主要集中在32~48kD和66~106kD之间。同时,分析其他11株水产动物主要弧菌和4株非弧菌属细菌共15株细菌外膜蛋白的SDS-PAGE图谱发现,11株弧菌的外膜蛋白图谱比较相似,而与非弧菌属细菌爱德华氏菌...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
郑宗林 郑曙明 Delbert M.Gatlin Ⅲ 汪开毓
为评价嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)PDK06株外膜蛋白A(omp A)的原核表达产物是否具有抗原性及其对斑点叉尾(Ictalurus punctatus)的免疫保护力,根据Gen Bank上嗜水气单胞菌外膜蛋白omp A基因序列(Gen Bank登录号:AF146597)设计去信号肽引物,扩增获得一段约1 000 bp的序列,经鉴定正确后,构建重组表达质粒p ET-32a(+)-pomp A;然后将该质粒转入BL21(DE3)后用IPTG诱导表达,经纯化后得到pomp A重组蛋白;最后将pomp Aomp A蛋白与弗氏不完全佐剂(FIA)混合免疫斑点叉尾,评价...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
郑宗林 郑曙明 Delbert M.Gatlin III 汪开毓
为评价嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)PDK06株外膜蛋白A(ompA)的原核表达产物是否具有抗原性及其对斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的免疫保护力,根据GenBank上嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因序列(GenBank登录号:AF146597)设计去信号肽引物,扩增获得一段约1000bp的序列,经鉴定正确后,构建重组表达质粒pET-32a(+)-pompA;然后将该质粒转入BL21(DE3)后用IPTG诱导表达,经纯化后得到pompA重组蛋白;最后将pompAompA蛋白与弗氏不完全佐剂(FIA)混合免疫斑点叉尾鮰,评价其免疫效果。结果显...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王 玉 冯建军 郭松林 林 鹏
在构建鳗鲡病原性嗜水气单胞菌与爱德华氏菌二联外膜蛋白重组表达载体的基础上，采用不同的诱导剂（IPTG）浓度、诱导温度、诱导时间和诱导时菌液浓度对重组表达载体的表达条件进行探讨。结果表明，不同诱导剂（IPTG）浓度、诱导温度、诱导时间和诱导时菌液浓度对该载体的表达无明显影响。在菌液浓度 D600nm=0.8时，采用0.25 mmol/L的 IPTG经16℃诱导培养过夜后表达。表达产物采用KTApurifier-100 蛋白质纯化仪，结合His标签柱亲和层析后获得分子质量87.1 ku的高纯度蛋白。蛋白经透析复性后免疫鳗鲡以初步研究其免疫原性。结果表明，免疫后第28天，重组蛋白不同剂量注射组的...
[期刊] 水产学报
[作者]
黄浦江 黄郁葱 简纪常 吴灶和 鲁义善 张雪利
参照GenBank上登录的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因序列,设计引物扩增OmpW的开放阅读框,序列分析结果显示该基因全长645 bp。将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌BL21中成功表达出带His-tag的融合蛋白,融合蛋白分子量约为43.8 ku,且主要以包涵体形式存在。优化的表达条件为37℃,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导时间5 h。将纯化的融合蛋白免疫SPF昆明小鼠制备多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价达1∶30 000,Western-blot结果表明鼠抗OmpW血清能与诱导后的重组蛋白发生特异反应,提示OmpW可能是哈维氏弧菌的一种重要保护性抗原...
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