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[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙小涵 张碧成 张强 何孔旺 张雪寒
【目的】口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)的传染性强,传播广,给世界经济和社会发展带来巨大危害,目前疫苗接种仍是主要而有效的防控手段。以增强口蹄疫疫苗免疫效力为目的,基于国内外对鞭毛蛋白佐剂的深入了解与研究,对非致病性大肠杆菌鞭毛进行修饰,研究鞭毛蛋白(flagellin,F)以及有无LTMT佐剂不同重组鞭毛蛋白对口蹄疫病毒(foot and mouth disease virse,FMDV)的佐剂作用。【方法】通过体外表达获得pCold-F0、pCold-F0-LTMT、pC
[期刊] 华北农学报
[作者]
张昱 王永录 张永光 潘丽
采用RT-PCR方法扩增口蹄疫病毒(FMDV)AF72株的3D聚合酶基因,并将其克隆至pGEM-T easy载体,测序分析结果表明,AF72 3D聚合酶基因与GenBank中公布的其他4个参考序列均具有较高的同源性。将目的基因插入原核表达载体pET-30a(+)中,构建了重组表达质粒pET-3D,鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,3D聚合酶基因在大肠杆菌中获得了正确表达,目的蛋白的分子量为46 ku。Western blot检测结果显示,表达产物可以与抗A型FMDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。
关键词：
口蹄疫病毒 3D聚合酶基因 原核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨苏珍 张改平 鲍登克 乔松林 万博 樊剑鸣 职爱民 李学伍
为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDVVP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析。结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性。结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王曼 祁克宗 涂健 周秀红 刘红梅 王惠珂 尹磊
[目的]建立检测禽致病性大肠杆菌phoP蛋白调控宿主菌DNA的方法,为进一步研究phoP蛋白的调控因子奠定基础。[方法]将pho P基因克隆至p MD19-T载体,序列鉴定正确后转至表达载体pET32a,将重组质粒pET32a-phoP导入感受态细菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析蛋白的大小,用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组phoP蛋白。通过生物信息学分析法对phoP蛋白与DNA的结合基序进行预测,利用凝胶迁移试验(EMSA)鉴定该蛋白的结合活性。[结果]酶切及测序结果表明原核表达质粒构建正确;SDS-PAGE结果表明目的基因得到表达;重组目的蛋白相对分子质量约为42...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
唐泰山 郭爱珍 陆承平
用大肠杆菌DNA作为鸡新城疫灭活苗的佐剂接种 15日龄雏鸡 ,以鸡新城疫油乳剂灭活苗为对照 ,用血凝抑制实验检测病毒特异性血凝抑制抗体。结果表明 ,大肠杆菌DNA及油乳剂两种佐剂均能增强特异性血凝抑制抗体的效价 ,二者组间抗体滴度差异不显著 ,但大肠杆菌DNA佐剂组雏鸡的体重明显高于油乳佐剂组 (P
关键词：
大肠杆菌DNA 新城疫 雏鸡 免疫增强
[期刊] 西南农业学报
[作者]
元振杰 王燕 夏晨阳 陈晓英 刘建枝 马勋
为了解HPI和LEE毒力岛在新疆致犊牛腹泻大肠杆菌中的流行情况,自2010年4月至8月,对新疆塔城市某集约化奶牛场10日龄内5头腹泻病死犊牛及7头严重腹泻犊牛进行病原分离鉴定,12头犊牛病料样品均分离到大肠杆菌。分离菌株进行小鼠腹腔注射均能造成小鼠发病,LD50从1.191×108~1.888×107。采用多重PCR检测LEE毒力岛的ler和eaeA基因和HPI毒力岛的irp2和fyuA基因。结果在分离的12株牛源大肠杆菌中,11株扩增出irp2+fyuA基因片段,1株扩增出fyuA+eaeA基因片段,而ler基因片段扩增均为阴性。结论:引起犊牛腹泻的致病性大肠杆菌中携带HPI毒力岛的情况非常...
关键词：
犊牛腹泻 大肠杆菌 毒力 毒力岛
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王娟芳 戴建君 姜敏 任建鸾 李德志 张鹏 孙建和 汤芳
[目的]本试验旨在建立一种能同时检测禽致病性大肠杆菌O_1、O_2和O_(78) 3种血清型的三重PCR检测方法。[方法]根据O_1、O_2和O_(78) 3种血清型的特异性基因片段设计并合成引物,分别提取O_1、O_2和O_(78)血清型禽致病性大肠杆菌的DNA作为模板,优化三重PCR反应条件,进行特异性和敏感性检测,并对临床模拟样品进行检测。[结果]在三重PCR的25μL反应体系中,dNTP 1.5μL,MgCl_22.5μL,Taq DNA酶0.6μL,O_1、O_2、O_(78)最佳引物加入量分别为0.6、0.2、0.6μL;最佳退火温度为55.9℃。三重PCR的特异性好,3种血清型之间无交叉反应;对146株不同血清型的大肠杆菌进行检测,准确率为99.32%(145/146),用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草芽胞杆菌进行特异性检测时,没有出现非特异性扩增。三重PCR敏感性高,以单一血清型DNA为模板时,O_1和O_2血清型的DNA最低检测限均为0.1 ng·μL~(-1),O_(78)血清型的DNA最低检测限为0.02 ng·μL~(-1);以O_1、O_2和O_(78)混合DNA为模板时,最低检测限为0.05 ng·μL~(-1)。对18份临床模拟样品进行检测,准确率为94.4%(17/18)。[结论]建立了一种能同时检测O_1、O_2和O_(78)3种血清型禽致病性大肠杆菌的三重PCR方法,方法特异性好,敏感性高,适用于临床上禽大肠杆菌病的快速检测。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
张燕 敖日格乐 王纯洁 姜晶 赵称赫 曹晓波
为研究乳酸链球菌素（ｎｉｓｉｎ）和四乙酸乙二胺（ＥＤＴＡ）的联合作用对５种血清型牛源致病性大肠杆菌（Ｏ＿１、Ｏ＿２、Ｏ＿８、Ｏ＿（７８）和Ｏ＿（８６））的体外抑菌效果，利用牛津杯法测定抑菌圈直径；结合微量稀释法和平板法测定最小抑菌浓度（ＭｉＣ）和最小杀菌浓度（ＭＢＣ）。结果表明：１）ｎｉｓｉｎ或ＥＤＴＡ单独使用无抑菌圈；２）将ｎｉｓｉｎ分成１２个质量浓度分别与０．１Ｍｇ／ＭＬ的ＥＤＴＡ相混合进行协同作用，均产生明显的抑菌圈，并且随着ｎｉｓｉｎ质量浓度的增加，抑菌圈越大；３）Ｏ＿８、Ｏ＿（７８）和Ｏ＿（８６）型大肠杆菌的ＭｉＣ均为０．０６３Ｍｇ／ＭＬ，而Ｏ＿１型的ＭｉＣ为０．０１６Ｍｇ／ＭＬ，Ｏ．．．
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
阿琪玛 敖日格乐 王纯洁 斯木吉德 畅旺东 阿日查 郭雪梅 陈玉洁
为研究中草药对5种血清型牛源致病性大肠杆菌(Escherichia coli O_1、E.coli O_2、E.coli O_8、E.coli O_(78)和E.coli O_(86))的体外抑菌效果,通过牛津杯法测定中草药对致病性大肠杆菌的抑菌圈直径,通过微量稀释法和平板法测定最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。结果表明:1)金银花和黄连对E.coli O1体外抑菌效果最好,抑菌圈直径分别为29.35和37.71mm,五味子对E.coli O8体外抑菌效果最好,抑菌圈直径为28.97mm。2
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
杨斯琴 敖日格乐 王纯洁 斯木吉德 包永光
为研究蒙药对牛源致病性大肠杆菌的体外抑菌效果,采用牛津杯法测定15种蒙药的抑菌圈直径,结果表明,其中朝您·哈日莫各和扫龙·吉木斯两味蒙药对5种血清型牛源致病性大肠杆菌抑菌效果较好,达到极敏和高敏;通过微量稀释法和平板法测定最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC),结果显示,朱如拉、朝您·哈日莫各、扫龙·吉木斯、浑钦、高勒图·宝日、给喜古讷和阿如拉等7种蒙药对5种血清型牛源致病性大肠杆菌综合抑菌效果较好,其MIC为0.063~0.500g/mL,MBC为0.125~0.500g/mL。
关键词：
蒙药 血清型 致病性大肠杆菌 抑菌作用
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
杨文仪 肖家伟 雷连成 张付贤
为查明南京市某赛鸽公棚赛鸽出现腹泻、死亡的致病病原，本研究对采集的病料进行病原分离鉴定，分析致病菌的血清型、生物被膜表型、毒力基因、耐药菌谱，并对分离菌株进行了人工感染试验。研究表明：1)从患病鸽组织、拭子和粪便中分离出的细菌初步诊断为大肠杆菌O157;分离菌株在NA平板上长出白色、光滑的圆形菌落，在CT-SMAC平板上长出紫红色菌落。2)分离菌株的16S rRNA基因序列与大肠杆菌的相似性达98%～99%,命名为E.c.86246。3)血清学试验表明分离菌株为大肠杆菌O157:非H7菌株，动力试验进一步证实其为动力株。4)分离菌株携带tccp1014、eaeA和hly毒力基因，可导致雏鸡胃肠道出现不同程度的功能损伤，甚至导致死亡；其半数致死量为2.0×10~5 CFU/mL,具有较强的致病性。5)分离菌株携带tetA、tetM、sul2、aadA1和bla_(TEM) 5种耐药基因，具有较弱的生物被膜形成能力，对四环素、氨基糖苷类等抗菌药物严重耐药，对阿莫西林、氧氟沙星和诺氟沙星敏感。综上，本研究分离的鸽源大肠杆菌O157:非H7菌株，具有动力性，有较强的致病性和一定的耐药性，为大肠杆菌O157的流行病学调查、致病机理分析和抗菌药物的精准施治提供理论依据和数据参考。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
吴晓妍 吴剑梅 傅丹丹 涂健 宋祥军 邵颖 祁克宗
[目的]探究毒素-抗毒素(TA)系统中毒素基因hipA对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性和致病性的影响,为深入研究TA系统和APEC的致病机制提供理论依据。[方法]利用Red同源重组方法,构建禽致病性大肠杆菌野生株AE81的hipA基因缺失株AE81△hipA及回复株C-AE81△hipA,测定其生长曲线、运动性、环境耐受能力、细胞黏附能力,并采用实时荧光定量PCR检测环境耐受相关基因(hdeA、hdeB)、黏附相关基因(finF、fimH)、毒力相关基因(hcp、ompR、ompC)的转录水平,探究毒素蛋白hipA对APEC的生物学功能及致病性的影响。[结果]成功构建hipA基因的缺失株和回复株。野生株AE81、缺失株AE81△hipA和回复株C-AE81△hipA的生长情况无明显差异。与野生株AE81相比,hipA基因缺失株AE81△hipA的运动能力降低,对酸性、碱性、高渗和氧化应激环境的耐受能力减弱,鞭毛和菌毛的数量和长度明显减小,对鸡胚成纤维细胞(DF-1)的黏附能力极显著减弱(P<0.01),回复株C-AE81△hipA各指标基本恢复到野生株水平。实时荧光定量PCR结果显示,与野生株AE81相比,AE81△hipA菌株的hdeA、hdeB、fimF、ompR、ompC基因转录水平显著降低(P<0.05),hcp基因转录水平差异不显著,但fimH转录水平显著升高(P<0.05)。[结论]TA系统毒素蛋白hipA影响APEC的运动性、环境耐受能力和对细胞的黏附能力,参与APEC的致病过程。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
白灏 韩先干 刘蕾 单雪芹 宋军 刘瑞 董洪亮 刘海文 丁铲 于圣青
【目的】研究信号分子AI-2对禽致病性大肠杆菌(APEC)的调控作用。【方法】采用改良结晶紫半定量法和荧光染色法检测AI-2对APEC生物被膜形成能力的影响。Real-time PCR检测AI-2对APEC毒力基因转录水平的影响。活菌计数法观察AI-2对APEC黏附和入侵鸡胚成纤维细胞DF-1的影响。【结果】AI-2在浓度为0.185 mmol.L-1时,生物被膜形成能力显著增强,而浓度为0.037mmol.L-1和0.285mmol.L-1时,生物被膜形成能力无显著变化。Real-time PCR结果显示加入AI-2后,APEC毒力基因pfs,vat,luxS,tsh,fuyA,iucD转录...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
杨斯琴 敖日格乐 王纯洁 满达 斯木吉德 刘文才
为确立治疗致病性大肠杆菌病的蒙药组方,采用牛津杯法,选取15味蒙药对致病性大肠杆菌进行体外抑菌试验,筛选O1血清型致病性大肠杆菌的敏感蒙药。结果表明,O1血清型致病性大肠杆菌对12味蒙药敏感。并通过棋盘法测定部分抑菌浓度,筛选出5组6味蒙药,结合体外抑菌试验,通过L8(27)正交试验设计,筛选出最佳体外抑菌蒙药组合,再通过L9(34)正交试验设计进行剂量优化。结果显示,结合正交设计和体外抑菌试验确立了5组蒙药组方,且其抑菌效果显著优于各单味蒙药的抑菌效果,即5组蒙药复方中最小抑菌圈为30.49mm,而单味蒙药最大抑菌圈为24.42mm。
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