【背景】非洲猪瘟（ASF）于2018年8月在中国首次出现，对养猪业造成了巨大危害，损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF，于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒（ASFV）特异性单克隆抗体，建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30，通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白，以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株；对P30蛋白进行截短表达，利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验（iELISA）鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位；并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证，结果显示构建出重组载体pET-28a-P30，经测序其序列未发生突变；IPTG诱导后，P30重组蛋白主要表达在包涵体中，分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1:1混合免疫小鼠，3次免疫后，小鼠血清效价达到1:102 400，说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆，获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞，Western Blot和间接免疫荧光试验（IFA）检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点；截短表达P30蛋白不同片段，选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应，显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化，成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法，检测了190份临床样品，并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比，两方法阳性符合率为90.91%，总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白，经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株，抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高，敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法，为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。

【目的】制备非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p30蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）并初步分析其所识别的线性抗原表位，为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原，免疫6—8周龄BALB/c雌鼠，每两周免疫1次，共免疫3次，首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫，第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化，3次免疫后1 w断尾采血，间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体效价，选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫，3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4:1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原，间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，有限稀释法进行克隆纯化，直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞，以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗，进行间接免疫荧光试验（IFA）。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜，分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗，进行Western blotting分析，筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因，其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体，p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体，原核表达部分重叠的截短p30蛋白，最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原，以5株MAbs为一抗，以兔抗鼠HRP-IgG为二抗，通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原，经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示，5株MAbs(8F4、1D3、1H2、6C3和8E11)与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA试验呈阳性；Western blotting结果显示，5株MAbs均能够与ASFV感染的细胞呈阳性反应，与未感染病毒的细胞呈阴性反应。试验构建的p30截短体重组蛋白GST-p30ab以可溶和包涵体两种形式表达，而GST-p30bc仅以包涵体形式表达，以两组截短体融合蛋白为包被抗原，通过间接ELISA检测出MAbs 8F4、1H2和6C3与两个重组蛋白均能有效结合，证明MAbs 8F4、1H2和6C3抗原识别区域为两组截短蛋白重叠区域，即第120—153位氨基酸；MAbs 8E11与1D3则只能与GST-p30ab蛋白结合，证明MAbs 8E11与1D3抗原识别区域为两个重组蛋白的非重叠区域，即第86—119位氨基酸。【结论】本研究可溶性地表达了p30蛋白的第86—153位氨基酸截短体重组蛋白，制备了5株p30 MAbs，定位到2个p30蛋白抗原表位。结合ELISA和IFA，可建立十分可靠的ASFV及其抗体的检测手段。

【目的】制备鸭瘟病毒（ＤＰＶ）ｇＢ蛋白单克隆抗体，为建立ＤＰＶ快速诊断方法及进一步鉴定ＤＰＶ的抗原表位奠定基础。【方法】克隆ＤＰＶｇＢ基因，构建其表达载体并进行原核表达，纯化ＤＰＶ ｇＢ蛋白，以其作为抗原免疫８周龄ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合，进行间接ＥＬＩＳＡ及亚克隆筛选，并对单抗亚类及抗原性进行鉴定。【结果】ＰｃＲ扩增出９１５ＢＰ的目的基因，成功连接于ＰＥＴ－２８Ａ载体，并转化大肠杆菌ＲｏＳＥＴＴＡ进行诱导表达，获得４株稳定分泌抗ＤＰＶ ｇＢ蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为Ａ８Ｄ７、Ｅ６ｃ３、Ｈ１１Ｆ８、Ｈ６Ｆ６，间接ＥＬＩＳＡ检测其腹水效价分别为１∶１０３、１．．．

为对猪瘟病毒(CSFV)建立更加有效的临床检测方法。用纯化的猪瘟兔化弱毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。经ELISA方法筛选和3次亚克隆,最终获得了5株能稳定传代并分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为:C7,C9,G9,G10和4E8,其分泌的单克隆抗体(McAb)为IgG1(G9,4E8)和IgG2a(C7,C9,G10)亚类。经鉴定,5株单抗细胞培养上清效价为1∶1 600~1∶3 200,腹水效价为1∶51 200~1∶102 400。交叉试验及特异性抗原阻断试验表明,所制备的McAb与其他抗原无交叉反应性,均完全针对猪瘟病毒(CSFV)抗原决定...

【目的】制备抗鸭坦布苏病毒（Ｄｕｃｋ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ，ＤＴｍｕｖ）Ｎｓ５蛋白的单克隆抗体。【方法】将实验室保存的ＰｅＴ２８ａ－Ｎｓ５载体转化入ｒｏｓｅＴＴａ（Ｄｅ３）感受态细胞中进行诱导表达，利用纯化的鸭坦布苏病毒Ｎｓ５蛋白作为抗原免疫ｂａＬｂ／ｃ小鼠，应用淋巴瘤细胞杂交技术结合有限稀释法制备单抗，并对单抗的特异性、反应性及其抗原表位和亚类进行鉴定。【结果】筛选获得２株稳定分泌针对ＤＴｍｕｖ的Ｎｓ５蛋白单抗的杂交瘤细胞，分别命名为ａ４Ｄ１和ｂ４ｂ８。此２株杂交瘤细胞诱导ｂａＬｂ／ｃ小鼠的抗体效价均可达到１∶６４ ０００。间接ｅＬｉｓａ、ＷｅｓＴｅｒＮ ｂＬｏＴ和间接免疫荧光（ｉＦａ．．．

[目的]制备日本脑炎病毒prM蛋白的特异性单克隆抗体，对进一步了解prM的结构和功能、开发特异性检测方法以及JEV prM蛋白的功能研究奠定基础。[方法]将prM基因克隆至原核表达载体pET-32a，诱导表达并纯化prM重组蛋白，随后将其免疫小鼠，通过细胞融合和亚克隆得到分泌抗prM单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水并进行效价测定，通过Western blot和IFA验证其特异性，并进行空斑中和试验测定其中和活性，利用原核表达多段截短体蛋白确定单克隆抗体抗原表位并进行保守性分析，将其初步应用于感染检测及亚细胞定位分析。[结果]经细胞融合和三次亚克隆后成功获得1株能稳定分泌抗prM单克隆抗体的细胞株，命名为4H6，所制备的腹水效价可达到1∶1638400，经鉴定该抗体重链属于IgG2b，轻链为κ型。Western blot以及IFA试验均证明该抗体具有良好的特异性。空斑减少中和试验显示4H6不具备中和活性。通过表达截短蛋白鉴定出4H6所识别的抗原表位位于³⁰GENRCWVRAIDVGYMC⁴⁵，结合生物信息学分析发现该表位位于prM蛋白表面且在JEV不同毒株之间高度保守，有利于抗原抗体的直接接触。并成功将4H6初步应用于JEV感染检测及prM蛋白亚细胞定位分析。[结论] 成功制备1种高效且特异性的JEV prM蛋白单克隆抗体，抗原表位识别区位于pr，为分析prM蛋白在病毒复制过程中的生物学功能以及与其他病毒蛋白（如E蛋白或宿主分子）之间的相互作用提供有效工具。

为了筛选P1病毒VP1蛋白的特异性单抗,通过生物信息学软件预测其抗原表位,然后利用SEALTM方法制备针对不同抗原表位的单抗,再通过免疫组化试验和Western Blot对其中6株进行分析,筛选敏感性强、特异性好的单抗。结果显示,选取的6株单抗中有3株(mAb1、mAb6和mAb9)在免疫组化染色时呈阳性反应,有1株(mAb1)在Western Blot中表现强阳性。研究筛选出了P1 VP1蛋白的特异性单抗,为P1病毒的检测和疫苗研究奠定了基础。

为制备番鸭呼肠孤病毒(MDRV)p10.8蛋白的单克隆抗体(mAb),利用原核表达系统表达p10.8蛋白,采用Ni-NTA亲和层析法对其进行纯化,选择BALB/c小鼠进行免疫.4免后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,并以纯化的重组p10.8蛋白作为抗原包被,用间接ELISA法筛选到1株针对MDRV p10.8蛋白的能稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株,命名为H3-7B株.用Western blotting法进行检测,以H3-7B株上清为一抗,分别与原核、真核表达系统获得的重组p10.8蛋白反应,结果均呈阳性.用抗体亚类试剂盒进行抗体亚类测定,显示H3-7B株mAb亚型为IgG2a类.用MDRV、禽腺病毒、鸭坦步苏病毒3种病毒与H3-7B株mAb进行Western blotting鉴定反应,特异性反应结果表明,H3-7B株mAb与MDRV反应呈阳性,特异性较好.结论:本试验成功制备了抗MDRV p10.8蛋白的mAb.

用体外表达的蛋白作为免疫原来制备特异的单克隆抗体,并对制备的抗体进行鉴定。将ARVσ3蛋白基因在体外扩增,扩增产物与载体PGEX-4T-1连接并在基因工程菌中表达,体外表达的蛋白经纯化后作为免疫原来制备特异的单克隆抗体和ELISA检测包被抗原,测定纯化后蛋白的浓度,按每鼠100μg的蛋白用量免疫BALB/c小鼠,免疫4次后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1进行融合。对融合后的杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,通过间接E-LISA方法测定其抗体效价,并通过Western Blot、Dot-ELISA、直接免疫荧光、病毒中和等方法对获得的单抗特性进行检测。结果通过纯化的病毒含量...

为建立一种用于快速检测赤羽病病毒抗体的竞争ELISA法。用AKV病毒免疫Balb/C小鼠，将其脾细胞与SP2/0细胞进行免疫融合，以获得抗AKV的单克隆抗体；利用Bac-to-Bac杆状病毒表达的SBV N蛋白作为诊断特异性抗原，山羊抗鼠HRP-IgG为二抗，建立并优化AKV抗体检测的竞争ELISA方法。得到一株持续稳定繁殖的能够分泌单抗AKV核蛋白抗体的杂交瘤细胞株，单抗亚型鉴定为：重链IgG1,轻链kappa,仅能与AKV病毒呈阳性反应，与BTV、FAMD、EHDV病毒等病毒抗原不发生特异性反应；建立的检测AKV抗体ELISA检测方法，诊断抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,1∶1 000抗体稀释比，1∶50血清稀释比，1∶2 000二抗稀释比，封闭条件为5%BSA,37℃封闭2 h,确定了血清抑制率大于等于44%时为阳性，小于44%为阴性；所建立的ELISA方法敏感性和特异性鉴定结果与ID Screen AKV Competition检测试剂盒一致。本试验成功制备出一株分泌针对AKV N蛋白的杂交瘤细胞系，建立的ELISA检测方法能够用于检测动物AKV抗体，为进一步开展AKV抗体诊断试剂工艺研究、产业化奠定了基础。

锯缘青蟹呼肠孤病毒(Scylla serrata reovirus,SsRV)第9节段(S9)编码的p40蛋白可能为病毒的甲基转移酶(methyltransferase)。为了便于确认p40在病毒复制过程中扮演的角色,将S9片段的开放阅读框(ORF)克隆到原核表达载体pET28a(+),实现了在宿主表达菌E.coli BL21(DE3)中的高效表达,进而纯化了重组表达蛋白p40(rp40),并制备了抗SsRV p40蛋白的2株单克隆抗体(4B7、3E5)。经Western blot分析表明,2株单克隆抗体均可特异地识别rp40蛋白,以及识别SsRV病毒蛋白中分子量为46 ku和40 ku 2条...

【目的】制备抗Zhangfei蛋白的单克隆抗体,并鉴定其特性。【方法】用Zhangfei融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0融合,筛选出阳性克隆,应用有限稀释法筛选抗Zhangfei蛋白的单克隆杂交瘤株;采用腹水诱生法制备单抗腹水,用饱和硫酸铵法纯化腹水抗体;采用间接ELISA、单克隆抗体亚型检测试剂盒、免疫印记技术、曲线拟合方案等分别鉴定单抗效价、亚型、特异性和亲和力等特性。【结果】免疫小鼠的血清抗体效价达1∶5 000以上,细胞融合克隆率为98.96%,阳性克隆率为30.18%,筛选出2株抗Zhangfei蛋白的单克隆杂交瘤细胞,其培养上清效价均达到1∶800,腹水单...

[目的]本试验旨在制备特异性鼠抗猪瘟病毒(CSFV)非结构蛋白NS3和NS5B的多克隆抗体。[方法]根据CSFV NS5B基因序列设计1对特异性引物,以CSFV石门株为模板PCR扩增NS5B基因,同时根据大肠杆菌对密码子的偏嗜性优化了NS3密码子,并将NS3和NS5B基因分别克隆至原核表达载体p Cold I,转化至大肠杆菌Rossetta 2(R2),经0. 1mmol·L-1IPTG诱导后进行融合蛋白的表达和纯化,常规免疫BALB/c小鼠制备抗血清。应用Western blot和间接免疫荧光技术鉴定了多克隆抗体的特异性。[结果]Western blot结果显示,该抗血清不仅能识别原核和真核表达的NS3和NS5B蛋白,也能识别细胞中感染的CSFV并产生特异性条带;间接免疫荧光检测结果表明,2种抗血清除均能与胞浆中的CSFV粒子发生反应外,也能识别宿主细胞中真核表达的NS3和NS5B蛋白。[结论]本试验成功表达了NS3和NS5B,且用其制备的抗血清具有生物学功能,为深入探究猪瘟病毒致病机制奠定了基础。

制备抗大鲵虹彩病毒（ＣＧＳＩＶ）ＭＣＰ ＣＯＥ蛋白的单克隆抗体，并对其基本特性进行鉴定及开展初步应用。用纯化的重组ＣＧＳＩＶ ＭＣＰ ＣＯＥ蛋白免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取免疫小鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，间接ＥＬＩＳＡ法检测阳性孔，经有限稀释法亚克隆，筛选单克隆杂交瘤细胞株。采用间接ＥＬＩＳＡ法、免疫印迹法和单克隆抗体亚型检测试剂盒等鉴定单抗的稳定性、特异性和亚型；采用腹水诱生法制备单抗腹水，饱和硫酸铵法纯化腹水单抗；间接ＥＬＩＳＡ法分别测定单抗杂交瘤细胞上清液和腹水单抗的效价；利用间接免疫荧光法观察ＣＧＳＩＶ的增殖。结果显示，细胞融合克隆率为９８．６８％，阳性率为２０．５２％，得到１株．．．