为探究青鳉胶质细胞源神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）在精巢中的细胞表达模式，及视黄酸（retinoic acid，RA）和11-酮基睾酮（11-ketotestosterone，11-KT）对其表达调控作用，本研究通过荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）检测了青鳉Gdnf的两个复制基因（即gdnfa与gdnfb）在精巢中的细胞表达模式，并通过实时定量聚合酶链式反应（real-time quantitative-polymerase chain reaction，qRT-PCR）、5’端上游序列转录活性分析等从组织、细胞及分子水平探究了精巢分化发育重要调控因子RA和11-KT对两者的表达调控作用。结果显示，在精巢中，gdnfa主要表达于体细胞，而gdnfb除表达于体细胞外，在生殖细胞中也有明显表达。不同浓度RA和11-KT处理体外培养的青鳉精巢组织及其传代培养体细胞MTS1，结果表明，两者均可显著下调gdnfa的表达，而上调gdnfb的表达。分别用gdnfa与gdnfb不同截短5’端上游序列的荧光素酶报告载体转染MTS1，结果显示，RA处理可降低gdnfa的多个截短5’端上游序列荧光素酶活性，而增强gdnfb的多个截短5’端上游序列荧光素酶活性，11-KT处理的结果与此基本相似。综上，青鳉gdnfa与gdnfb在精巢中具有差异的细胞表达模式，同时两者在组织、细胞及分子水平均受到了RA和11-KT的差异化调控。本研究深化了我们对于鱼类Gdnf两个复制基因的细胞表达模式及其调控的深入认识，为其进一步生物学功能研究奠定了重要基础。

为探究Smoothened（Smo）信号在精巢不同细胞增殖与存活中的作用，分离鉴定了尼罗罗非鱼smo（命名为Onsmo），检测了其在不同组织中的表达分布及在精巢中的细胞表达模式，在尼罗罗非鱼精巢组织的体外培养体系中，用Smo特异性激动剂SAG或抑制剂环巴胺分别进行处理，EdU掺入法及TUNEL法检测了处理后生殖细胞（Vasa~(+)）、Sertoli细胞（Amh~(+)）与Leydig细胞（Cyp17a1~(+)）增殖或凋亡情况。结果显示，Onsmo开放阅读框全长2 478 bp，编码825个氨基酸，含有7次跨膜结构域，与人SMO氨基酸一致性达77%；Onsmo表达于包括精巢在内的多个组织；在精巢中，Onsmo表达于多种不同类型细胞，包括精原细胞、精母细胞、Sertoli细胞以及Leydig细胞；在精巢组织的体外培养体系中，SAG处理对精原细胞增殖具有显著促进作用，而环巴胺处理对Sertoli细胞、Leydig细胞凋亡具有显著促进作用。从而表明，OnSmo信号在尼罗罗非鱼精巢精原细胞增殖与体细胞存活中具有重要作用。该研究首次证实了Smo信号在鱼类精巢不同细胞增殖与存活中的作用，为进一步研究其作用机制奠定了重要基础。

【目的】预测母猪Kiss1(GenBank Gene ID:100145896)上游区域潜在的转录因子结合位点,并验证部分转录因子在猪卵巢颗粒细胞中对Kiss1基因的调控作用,为研究Kiss1基因在母猪卵巢颗粒细胞中的分子调控机制提供理论基础。【方法】参考NCBI数据库中Kiss1基因上游区域的序列,通过生物信息学网站预测的Kiss1基因上游区域潜在转录因子结合的位点,结合文献阅读与资料查询,在转录因子CEBPα和p53与Kiss1基因上游区域潜在结合位点附近设计引物,利用染色质免疫共沉淀(ChIP)技术,验证转录因子CEBPα和p53与Kiss1基因上游区域的结合情况;参照NCBI数据库相关转录因子CEBPα和p53的mRNA序列,使用软件Primer Premier5设计引物,PCR分别扩增转录因子CEBPα(带有Kpn I和Xho I限制性内切酶的酶切位点)和p53(带有Kpn I和Hind III限制性内切酶的酶切位点)的CDS区序列,并进行测序鉴定,连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建含有潜在转录因子CEBPα和p53 CDS区序列的真核表达载体,并获得无内毒素质粒,分别命名为pcDNA3.1-CEBPα和pcDNA3.1-p53;化学合成目标转录因子CEBPα和p53的干扰siRNA片段。屠宰场采集猪的卵巢,快速分离并培养原代猪的卵巢颗粒细胞,阳离子脂质体转染法分别将转录因子CEBPα和p53真核表达载体(pcDNA3.1-CEBPα和pcDNA3.1-p53)或siRNA片段(CEBPα-siRNA和p53-siRNA)转染进母猪卵巢颗粒细胞,使用实时荧光定量PCR和Western Blot技术分别验证预测的转录因子CEBPα和p53对Kiss1基因mRNA水平和蛋白水平的影响。【结果】生物信息学预测结果表明,Kiss1基因上游区域(-850—+221)存在p53(肿瘤抑制蛋白,tumor protein p53,p53)、CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein, CEBP)、信号传导及转录活化家族Stat4(signal transducer and activator of transcription 4, Stat4)等转录因子的潜在结合位点,其中转录因子p53(GenBank Gene ID:397276,NM_213824.3)可能结合在Kiss1基因上游区域-533—-523 bp处,转录因子CEBPα(GenBank Gene ID:397307,XM_003127015.4)可能结合在Kiss1基因上游区域-744—-733bp处;ChIP结果表明,转录因子p53和CEBPα可以特异性的结合在Kiss1基因上游区域-533—-523 bp和-744—-733 bp处;在母猪卵巢颗粒细胞中超表达转录因子p53或CEBPα后,Kiss1基因的mRNA的表达水平显著下降(P<0.05),蛋白水平显著下降(P<0.05);在母猪卵巢颗粒细胞中,干扰转录因子p53或CEBPα后,Kiss1基因的mRNA的表达水平显著升高(P<0.05),蛋白水平显著升高(P<0.05)。【结论】在猪卵巢颗粒细胞里,转录因子p53和CEBPα能结合到Kiss1基因的上游区域降低其启动子转录活性,进而降低其mRNA和蛋白表达水平。

应用抑制差减杂交(SSH)技术构建了施氏鲟(Acipenser schrenckii)精巢和卵巢组织的SMART cDNA文库及其cD-NA差减文库,从两个差减文库中随机挑取200个克隆进行PCR检测,随机挑选其中的123个cDNA克隆测序。将所测序列经GenBank检索和生物信息学比较,发现有55个cDNA片段序列在GenBank上无明显的同源性,68个片段与已报道的基因有较高的同源性,其中17个cDNA片断为精巢中特异表达的基因,而51个为卵巢中特异表达的基因。精巢中大量表达的主要为延长因子(EF-1)和脂肪酸连接蛋白等与精子生成发育有关的基因,而卵巢主要为ZPC、组蛋白和周期蛋白等与卵细...

本研究以重要的海水养殖鱼类半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)为研究对象，克隆了其白细胞介素12 (IL-12)的p35a亚基和p40c亚基的基因编码区序列，编码区长度分别为651 bp和984 bp。系统进化树分析显示，半滑舌鳎的p35a和p40c分别与其他鱼类对应的基因聚为一支。氨基酸同源性分析显示，p35a与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)相似性最高，p40c与三棘刺鱼(Gasterosteus aculeatus)相似性最高，分别为52.04%和48.67%。组织表达分析显示，p35a在鳃、脑、心和卵巢中表达量较高，p40c在肝、脾、鳃和心中表达量较高。通过哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染实验，分析了半滑舌鳎p35a、p40c及其相关基因(ifn-γ和il-10)在哈维氏弧菌感染过程中的表达模式，p35a在脾中，48 h表达显著上升(P

为探究视黄酸（RA）在鱼类精原干细胞（SSC）增殖与分化中的作用，实验首先以三色荧光报告载体pGRY [延伸因子1α启动子驱动组蛋白H2B-绿色荧光融合蛋白、减数分裂联会复合体蛋白3（Scp3）启动子驱动嘌呤霉素红色荧光融合蛋白、精蛋白启动子驱动黄色荧光蛋白] 转染青鳉精原干细胞系SG3，获得稳转细胞SG3-pGRY，然后分别在2D与3D培养条件下检测RA信号对其增殖与分化的影响。结果显示，稳转细胞SG3-pGRY的红色荧光可监测细胞内源性Scp3的表达，且细胞仍保持干性及分化潜能，表明其可用于监测细胞分化状态。在2D培养条件下，即在细胞培养板中待细胞生长密度约90%就进行传代培养，RA可显著抑制细胞增殖，其受体α、β、γ泛抑制剂BMS493可促进细胞增殖；第48小时，RA处理可下调细胞多能性相关基因pou5f3、klf4表达，上调减数分裂相关基因dazl表达，但对其他减数分裂相关基因如scp3表达无明显影响；第8天，处理组及对照组均未能观察到红色荧光，这与已有报道RA处理体外培养小鼠SSC可显著促进Scp3表达，并进入减数分裂I期偶线期的研究结果明显不同。在3D培养条件下，即用96孔球形低吸附微量培养板进行培养，48小时后细胞成球状体聚集生长，RA、 BMS493处理组、对照组在48 h后均观察到明显红色荧光，减数分裂相关基因表达与2D相比显著上调；第8与第34天，RA处理组减数分裂相关基因表达均显著高于对照组，而BMS493处理组低于对照组。研究表明，RA信号可抑制SG3增殖，促进其分化，但不是诱导细胞发生减数分裂的关键分子。本研究不仅为鱼类SSC分化相关研究提供了良好研究模型，而且促进了对于RA信号在鱼类SSC增殖与分化中作用的深入认识。

通过研究两种酶对精巢细胞的消化效果，探究抗冻剂、降温程序、糖类和卵磷脂对达氏鲟（Ａｃｉｐｅｎｓｅｒ ｄＡｂｒｙＡｎｕｓ）精巢细胞冻存效果的影响，获得消化冻存后高存活率的细胞。实验使用０．２５％胰蛋白酶和２ ｍｇ／ｍ Ｌ胶原酶Ｈ＋５００ ｕ／ｍ Ｌ中性酶ｉｉ的组合酶对达氏鲟精巢细胞进行消化，获得不同消化时间内的活细胞数量。另外，还研究了冷冻稀释液中分别添加１０％二甲基亚砜（ｄｍｓＯ）、乙二醇（ｅｇ）、甲醇（ｍｅＴ）作为抗冻剂，采用－１℃／ｍｉｎ慢速降温以及直接投入液氮中的快速降温方法冻存，冷冻稀释液采用ｄ－海藻糖或同浓度ｄ－蔗糖，以及添加５％、８％、１１％卵磷脂对冻存效果的影响。结果显示：两种消．．．

【目的】研究半番鸭与番鸭精巢组织转录组差异表达基因,为进一步阐明半番鸭不育的遗传机制奠定理论基础。【方法】利用转录组测序方法对半番鸭和番鸭的精巢组织进行研究,筛选其差异表达基因,并对其功能进行注释和荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,QRT-PCR)验证。【结果】测序共获得43.84Gb Clean Data,组装后共获得193 535条Unigene。DESeq分析发现3 597个基因在两个鸭品种间差异表达,其中上调基因1 194个和下调基因2 403个,包括与生殖功能

为了探索适用于体外培养的鱼细胞外源基因转入方法,本研究通过构建红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)转录因子Sox2的重组表达载体p ET32a(+)-Sox2-11R-6His,诱导表达并纯化得到了C末端连接多聚精氨酸(11R)的重组蛋白Sox2-11R-6His,以其与红鳍东方鲀精巢细胞系细胞共孵育12 h后,光镜观察结合Western Blot检测发现重组蛋白进入细胞的效率与浓度呈剂量依赖关系且最佳孵育浓度为8μg/m L,当重组蛋白质量浓度达到10μg/m L时,表现出明显的细胞毒性。对外源蛋白进行免疫荧光标记定位,发现重组蛋白分布于细胞质,部分进入到细胞核中。证明了穿膜肽1...

采用qRT-PCR方法分析性成熟半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)不同发育时期卵巢卵母细胞的孕酮受体膜组分1(PGRMC1)mRNA的表达,研究发现,在发育Ⅳ期的卵巢,处于第Ⅳ时相的卵母细胞PGRMC1 mRNA表达量最高(P<0.05),表明PGRMC1主要在卵母细胞成熟阶段发挥作用。PGRMC1对HCG调控作用的正向应答效应预示其参与了卵母细胞成熟调控,为进一步探讨PGRMC1在半滑舌鳎繁殖过程的功能提供重要基础资料。

为了探究microRNA(miRNA)对乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus, SHVV)感染月鳢细胞(striped snakehead cell, SSN-1)的影响,本研究对SHVV感染的SSN-1细胞及未感染的细胞进行miRNA高通量测序。分别用U6、β-actin和5S rRNA作为内参基因研究SHVV感染对细胞内22个高丰度(transcripts per million, TPM≥1 000) miRNA表达水平的影响,结果显示,U6基因作为内参时,SHVV感染对β-actin没有显著影响,但是5S rRNA显著上调表达,说明U6和β-actin基因适合作为内参基因研究SHVV感染对miRNA表达水平的影响。此外,我们研究了14种miRNA对SHVV增殖的影响。结果发现,miR-27a-3p、miR-26a-5p、miR-30e-3p等11种miRNA显著促进SHVV增殖,miR-150和miR-216b显著抑制SHVV增殖。进一步研究发现高丰度的miR-100-5p在SHVV感染SSN-1细胞早期上调表达,晚期下调表达。过表达miR-100-5p可以显著抑制SHVV的增殖,而抑制表达miR-100-5p可以显著促进SHVV的增殖。本研究为开发抗SHVV的核酸药物提供了理论基础。

以牦牛为试验对象,旨在克隆牦牛CCAAT/Enhancer Binding Protein Alpha(CEBPα)基因,预测其蛋白结构和功能,同时分离得到牦牛脂肪细胞,并检测CEBPα在牦牛不同组织中的表达及牦牛脂肪细胞诱导分化过程中的表达。采集成年牦牛(4岁)的心、肝、脾、肾、胃、小肠、皮下脂肪、内脏脂肪和肌肉组织,利用PCR技术获得CEBPα基因序列,得到其CDS序列;生物信息学的方法预测该基因的序列同源性及蛋白结构;通过实时荧光定量PCR检测CEBPα在牦牛不同组织的表达;通过胶原酶消化法,分离得到牦牛前体脂肪细胞;RT-PCR检测CEBPα在诱导分化0,3,6,9 d的表达模式。结果表明,牦牛CEBPα基因的CDS序列长度为645 bp,编码214个氨基酸。牦牛CEBPα基因与普通牛(Bos taurus)的同源性相对较高,核酸同源性为99.73%,氨基酸同源性为99.19%。构建系统进化树的结果显示,牦牛与普通牛和绵羊的相似性较高。CEBPα蛋白为具有跨膜结构、发生磷酸化/去磷酸化的不稳定亲水性蛋白,蛋白质的二级结构以α螺旋(27.10%)和无规则卷曲(67.29%)为主。qRT-PCR结果显示,CEBPα基因在牦牛皮下脂肪组织中表达最高,在肾、脾和内脏脂肪组织中低表达。CEBPα在牦牛脂肪细胞诱导分化过程中表达量逐渐升高。本试验克隆获得了CEBPα的CDS区序列,确定了其在牦牛各个组织中的表达量并明确了该基因在牦牛脂肪细胞诱导分化过程中的表达模式。为揭示CEBPα基因在牦牛脂肪组织和脂肪细胞中的功能提供基础数据。

[目的]本文旨在探究长链非编码RNA（long no-coding RNA，lncRNA）MSTRG.96141.1转录本表达特征及参与湖羊卵巢颗粒细胞凋亡（granulosa cell，GC）的调控机制。[方法]挖掘课题组前期高低繁湖羊(高繁，High prolificacy Fec^BB，HPBB；低繁，Low Prolificacy Fec^BB，LPBB)健康优势卵泡（> 5 mm）全转录组测序数据，鉴定到差异miR-3957-3p，采用生物信息学、双荧光素酶报告等方法确定与miR-3957-3p存在靶向关系的lncRNA；在此基础上，以湖羊GC为模型，采用过表达/干扰、qRT-PCR、FSIH、细胞流式术等技术，分析其表达特征和对湖羊GC凋亡的影响。[结果]miR-3957-3p表达水平HPBB组显著低于LPBB组；lncRNA（MSTRG.96141.1）与miR-3957-3p存在靶向关系；该转录本在湖羊生殖器官中的卵巢上表达最高，HPBB组显著高于LPBB组；进一步在湖羊卵巢GC中检测到该转录本的阳性信号，且定位于GC细胞质；干扰MSTRG.96141.1上调BAX基因mRNA表达水平和BAX:Bcl-2比率，进而促进湖羊GC凋亡；过表达miR-3957-3p上调BAX基因mRNA表达水平和BAX:Bcl-2比率，下调Bcl-2基因mRNA表达水平，进而促进湖羊GC凋亡；干扰miR-3957-3p则与之相反。[结论]MSTRG.96141.1通过吸附miR-3957-3p参与调控湖羊GC凋亡，进而影响卵泡发育。而MSTRG.96141.1能否作为湖羊繁殖力的分子标记，还需要进一步探究。

采用半定量RT-PCR技术检测分析了在体外培养的猪成纤维细胞内分别添加终浓度为0.5,5,10,30μg/μL的维生素A后,分别作用12,24,48和72 h后,视黄酸受体γ基因(RARγ)的表达变化情况。结果表明,不同浓度组间差异不显著,但是分别作用24和72 h后,会出现抑制RARγ基因表达的现象。

有性繁殖的性别决定机制虽具有多样性，但其生殖细胞都经过几轮有丝分裂和增殖后进入减数分裂，最终产生雌性或雄性配子。尽管有丝分裂过程中的生殖细胞在形态上没有雌雄差异，然而，未分化的生殖细胞在有丝分裂过程中如何获得雌雄性别特征尚不清楚。青鳉(Oryziaslatipes)正常（gsdf~(+/+)）XX卵巢、正常（gsdf~(+/+)）XY精巢以及性腺体细胞衍生因子（gonadalsoma-derivedfactor，gsdf ）缺失型（gsdf~(-/-)）卵巢的蛋白质组学质谱比对分析结果显示，gsdf~(-/-)XY卵巢中Tsn（Translin）蛋白产物显著高于gsdf~(+/+)XX卵巢，提示了Tsn蛋白表达可能受 dmy (DM-domain on Y chromosome，又名dmrt1bY）及下游的雄性信号调控。从青鳉性腺组织的cDNA中克隆了tsn基因的ORF（Open Reading Frame）片段。氨基酸序列的同源性比对分析及系统发育树评估显示，Tsn在脊椎动物物种间具有进化保守性，青鳉和斑马鱼(Danio rerio)的Tsn氨基酸序列高度同源。反转录PCR和实时荧光定量PCR检测结果显示，tsn的mRNA在野生型青鳉多个组织中广泛表达，其中在精巢中的表达量显著高于卵巢。用免疫荧光检测发现，gsdf~(-/- )XY卵巢中抗青鳉Tsn抗体阳性反应的囊性生殖细胞异常增多，同蛋白组学分析得到的gsdf~(-/- )XY卵巢中Tsn蛋白表达量高于gsdf~(+/+)XX卵巢的结果相一致。本研究表明，在青鳉性腺分化发育过程中，Gsdf信号可能抑制Tsn阳性的雄性囊性生殖细胞增殖，当该信号被破坏后，这种抑制作用消失，导致Tsn阳性生殖细胞在gsdf~(-/-) XY卵巢中大量积累。青鳉Tsn阳性生殖细胞的囊性增殖，是青鳉有丝分裂期生殖细胞雄性分化的特征之一，为脊椎动物有丝分裂期生殖细胞的雌雄性别鉴定提供了线索。