为有效控制苹果树腐烂病,通过对不同浓度青霉素处理后的感病植株的病原菌的果胶酶和人工培养的病原菌的果胶酶活性的测定。结果表明:不同浓度青霉素液处理对PA液中病源菌分泌果胶酶活性没有直接的抑制作用;不同浓度青霉素液对感病树体上病源菌分泌果胶酶活性有显著的抑制作用,其中经1.2×104U/L的青霉素液处理后的抑制效果最明显,处理35 d时,感病树体的病组织中果胶酶活性比CK下降了82%。

【目的】探索苹果树腐烂病菌致病力与胞外果胶酶的关系,筛选最佳产酶的碳、氮源,为揭示该病菌致病机理提供依据。【方法】用MS培养基培养苹果树腐烂病菌野生型菌株03-8及其2个突变体(致病力增强突变体X907,致病力丧失突变体T1)菌株,于5,10,15和20d取样,用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定其培养滤液中果胶酶的活性,探讨致病力与酶活性的关系。以野生型菌株03-8为供试菌株,改变MS培养基中的碳(葡萄糖、麦芽糖、根皮苷、果胶、可溶性淀粉)、氮(硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、L-天门冬酰胺)源培养03-8菌株,于5,10,15和20d取样,分别测定各培养滤液中果胶酶的活性,确定最佳碳...

【目的】探索苹果树腐烂病菌致病力与胞外果胶酶的关系，筛选最佳产酶的碳、氮源，为揭示该病菌致病机理提供依据。【方法】用MS培养基培养苹果树腐烂病菌野生型菌株03-8及其2个突变体(致病力增强突变体X907，致病力丧失突变体T1)菌株，于5，10，15和20 d时取样，用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定其培养滤液中果胶酶的活性，探讨致病力与酶活性的关系。以野生型菌株03-8为供试菌株，改变MS培养基中的碳(葡萄糖、麦芽糖、根皮苷、果胶、可溶性淀粉)、氮(硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、L-天门冬酰胺)源培养03-8菌株，于5，10，15和20 d时取样，分别测定各培养滤液中果胶酶的活性，确...

【目的】腐烂病是苹果树的重要枝干病害,主要造成死枝、死树。论文旨在明确低温等环境因子和枝条龄期等寄主因子对腐烂病菌(Valsa mali)侵染致病的影响,分析腐烂病流行成灾的原因,为腐烂病的流行预测和防控提供依据。【方法】通过人工控制环境条件下的接种试验,检测腐烂病菌在苹果枝干各部位的定殖率,观测腐烂病菌在伤口内的定殖部位,测试低温冷冻、枝条浸水后冰冻、枝条失水、枝条龄期等因子对接种腐烂病菌侵染致病的影响。【结果】8月份用分生孢子喷雾接种的苹果树,次年3月份检测,7个枝位的带菌率都接近或超过90%;接种到伤口上的腐烂病菌主要定殖于伤口坏死组织内,并在死组织内生长扩展,但没有穿透伤口外围的愈伤木栓层而侵入活体的皮层组织致病;在检测的6个枝位中,新鲜伤口对腐烂病菌侵染致病最为敏感,接种发病率最高,果柄痕次之,叉丫、芽眼和果苔枝的敏感性稍差,发病率稍低,皮孔抗病性最强,接种病菌不能致病;低温冷冻和浸水后冰冻(枝条上形成冰晶)都能增加枝条芽眼部位对接种腐烂病菌的感病性,其中-25和-18℃两个温度下处理枝条的接种发病率显著高于-10、-7和0℃3个温度处理枝条的接种发病率,浸水后冰冻枝条(模拟冬季降水后结冰的枝条)的接种发病率显著高于相同温度处理未结冰枝条的发病率;在低温冷冻和浸水后冰冻处理的枝条中,一年生枝条的接种发病率显著高于二年生枝条的发病率;一年生枝条经浸水冰冻处理后,梢部的接种发病率显著高于同一枝条基部的发病率;浸水后冰冻再经失水处理枝条(模拟枝条越冬后因大风、高温等失水),对腐烂病菌的侵染致病更加敏感,接种发病率显著高于浸水后冰冻枝条的发病率,而且失水量越大,接种发病率越高,芽眼部位的接种发病率最高可达85%。【结论】腐烂病菌易在苹果枝干上定殖,定殖病菌主要在伤口或枝干表层死组织内存活并生长,定殖病菌能否侵染致病关键取决于环境因子对枝条栓皮层的破坏;低温冷冻,尤其低于-15℃的低温冻害能破坏枝条的栓皮层和皮层,增加苹果枝条对腐烂病菌侵染致病的敏感性;与低温冷冻相比,浸水后冰冻对枝条栓皮层的破坏作用更大,结冰枝条对腐烂病更加敏感;枝条浸水冰冻后再失水,对枝条的破坏作用尤为严重,枝条越冬后失水能显著增加其对腐烂病菌侵染致病的敏感性;枝条的龄期不同,栓皮层的发育成熟度、强度和韧度各不相同,受不良环境因子的影响后,其受到破坏的程度也不同;树体不同部位栓皮层的结构不同,对腐烂病菌侵染致病的敏感性也存在明显差异。

【目的】腐烂病菌(Valsa mali)在苹果树枝干木质部内生长扩展是导致剪锯口发病和旧病斑复发的重要原因,本研究旨在明确环境因子对腐烂病菌在枝干木质部内生长扩展的影响,为苹果腐烂病的流行预测和防控提供依据和参考。【方法】采用菌饼接种离体富士苹果枝条剪口后,用活体皮层检测病菌在枝条木质部内生长扩展距离的方法,研究温度、枝条相对含水量、枝条龄期、高温处理与浸水等因子对腐烂病菌在木质部内生长扩展的影响;采用菌饼接种离体、活体富士枝条剪口,系统监测腐烂病菌在枝条木质部内的周年生长扩展动态;通过离体培养,测试病菌在枝条不同组织配制培养基内的生长速度。【结果】腐烂病菌能够利用木质部内的水溶性养分生长扩展,病菌在木质部内的生长扩展速度显著快于在皮层内的生长速度;在5—35℃的范围内,腐烂病菌在苹果枝条木质部和皮层内都能生长扩展,最适温度为30℃;在浸水枝条木质部内,腐烂病菌的扩展距离显著短于未浸水枝条;当枝条的相对含水量大于90%时,腐烂病菌在木质部内的生长扩展速度较快,当枝条的含水量低于90%时,病菌的生长扩展受到明显的抑制;病菌在当年生枝条木质部内的生长扩展速度显著快于在2—3年生枝条木质部内的扩展速度;在经高温处理枝条木质部内,腐烂病菌的扩展速度显著快于未处理枝条;在用木质部粉末、韧皮部粉末、木质部浸出液、韧皮部浸出液制作的培养基中,腐烂病菌都能正常生长,其生长速度和生长量都不低于在PDA中的生长;腐烂病菌在韧皮部培养基中,气生菌丝多,在木质部培养基中气生菌丝少;自然条件下,接种到枝条剪锯口上病菌的生长扩展速度主要受温度的影响,12月至次年3月份,腐烂病菌在活体的富士枝条内扩展速度很慢,3—11月份扩展较快。【结论】腐烂病菌在木质部内可利用可溶性养分生长,其扩展速度显著快于在皮层内的扩展速度;腐烂病菌在木质部内的生长扩展速度受温度、枝条含水量、木质部的致密程度等因素的影响。

为探究苹果树腐烂病菌β-葡萄糖苷酶基因VmGluI的序列特征及其在病菌侵染致病过程中的表达,以强致病力菌株LXS080601为材料,利用RT-PCR技术克隆基因c DNA序列,通过生物信息学软件对VmGluI编码蛋白的系统进化关系、理化性质和二级结构进行分析,采用实时荧光定量PCR技术测定VmGluI的表达量。结果显示,苹果树腐烂病菌VmGluI的开放阅读框为1 689 bp(GenBank登录号KY646110),编码562个氨基酸,蛋白分子量62.7 k Da。VmGluI编码的蛋白具有糖基水解酶1家

通过对酶活性的分析,研究证实苹果树腐烂病菌在活体外和寄主体内均能分泌一系列的细胞壁降解酶:多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、纤维素酶(Cx)、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶。不同碳源培养条件下,腐烂病菌产生细胞壁降解酶的活性及达到酶活性高峰的时间存在显著差异;诱导酶液对苹果愈伤组织具有明显的浸解作用,其中木聚糖为碳源产生的细胞壁降解酶,破坏能力最强。此外,研究发现,腐烂病菌在寄主体内产生细胞壁降解酶的活性变化规律不同,PMG和木聚糖酶在接种后最先被检测到活性显著升高,PMG酶活性于接种后第13天达到高峰,随后活性降低,而木聚糖酶和其他3种酶活性则随接种天数的增加活性不断增强;...

为了确定鹅源草酸青霉产果胶酶发酵的最佳培养基组成及发酵条件,以鹅源草酸青霉为研究菌株,通过聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶裂解酶(PL)、果胶酯酶(PE)的测定,研究了培养基组成(碳源、氮源、无机盐)及不同发酵条件(接种量、温度、pH和发酵时间)对草酸青霉产果胶酶活力的影响,并通过L9(34)正交试验确定草酸青霉发酵生产果胶酶不同组分的最佳培养基组成。结果表明:(1)以葡萄糖为碳源可以诱导PG、PL、PE产生(p<0.001),每15g基础培养基中葡萄糖的最适添加量分别为:1.2g,1.5g,1.5g;(NH4)2SO4对PG、PE、PL产生有明显刺激作用(p<0.001),每15g基础培养基适宜...

通过液体培养方法研究补骨脂提取物对苹果腐烂病菌菌丝生长的抑制作用,同时探究补骨脂提取物对病原菌菌丝体内几丁质酶及-β1,3葡聚糖酶活性的影响。结果表明:当补骨脂提取物浓度为5,10,20,40,80 mg·L-1时,对苹果腐烂病菌菌丝干重的抑制率分别为39.8%,62.3%,79.4%,90.6%,98.3%;用50mg.L-1补骨脂提取物处理在液体培养3d的苹果腐烂病菌,处理后1,3,6,12h菌体内几丁质酶活性分别为对照的1.32,3.62,3.34,2.47倍;β-1,3葡聚糖酶活性分别为对照的4.78,9.98,5.83,3.53倍。由此表明,补骨脂提取物对苹果腐烂病菌具有明显的抑制作...

为探明肉桂精油对苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌的抑制作用并初步探究其对苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌的抑制机理，使用菌丝生长速率法和熏蒸法观察不同质量浓度肉桂精油处理下苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌的菌落直径，测定肉桂精油对苹果腐烂病和番茄灰霉病的活体组织抑制效果，探究肉桂精油对苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌菌体的形态变化、细胞膜通透性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）、可溶性蛋白和还原糖含量的变化规律。结果表明：1）菌丝生长速率法测得肉桂精油质量浓度为250 mg/L时，对苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌抑菌率分别为98.31%和99.06%；熏蒸法测得肉桂精油质量浓度为8 000 mg/L时，对苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌抑菌率分别为50.57%和58.79%。2）当肉桂精油质量浓度为5 000 mg/L时，对苹果腐烂病和番茄灰霉病活体抑制效果分别为54.30%和64.10%。3）经肉桂精油处理后的苹果腐烂病菌菌丝和番茄灰霉病菌菌丝干瘪、坍塌，表面有分叉，菌液电导率上升，菌体SOD酶活性下降，MDA含量上升，可溶性蛋白和还原糖含量下降，最终扰乱菌体各项生理生化反应，进而达到抑菌效果。本研究可为开发防治苹果腐烂病和番茄灰霉病的植物源农药提供依据。

【目的】前期转录组分析表明苹果树腐烂病菌（Ｖａｌｓａ ｍａｌｉ）两个多聚半乳糖醛酸酶（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ，ｐｇ）基因Ｖｍｐｇ７和Ｖｍｐｇ８在病菌侵染定殖过程中显著上调表达。论文旨在分析Ｖｍｐｇ７和Ｖｍｐｇ８在病菌营养生长、致病力、果胶酶活性、对果胶的利用等方面的作用及基因双敲除对同家族内其他基因表达水平的影响，明确Ｖｍｐｇ７和Ｖｍｐｇ８在病菌致病过程中的生物学功能，为进一步解析苹果树腐烂病菌致病分子机理提供基础。【方法】通过ｑ ｒｔ－ｐｃｒ检测基因在病菌侵染过程中的表达水平及基因双敲除后ｐｇ家族内其他ｐｇ基因的表达量；利用ｄｏｕｂｌｅ－ｊｏｉｎｔ ｐｃｒ构建基因敲除载体并通过ｐ．．．

【目的】利用反向遗传学方法构建苹果树腐烂病菌(Valsa mali)中表达GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1的敲除载体,通过同源重组的方法进行基因敲除分析目标基因的功能,为全面解析苹果树腐烂病菌致病的分子机制奠定基础,并为有效控制苹果树腐烂病的方法技术和药剂研制提供理论依据。【方法】通过对笔者实验室苹果树腐烂病菌转录组数据的分析比对得到GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1(暂命名),该基因在接种5 d后,在病组织中表现出一定的上调表达,推测该基因可能与苹果树腐烂病菌致病相关。采用Double-joint PCR方法,将目标基因Vmgtp1的上游片段UP、下游片段DOWN及筛选标记潮霉素磷...

为降低再造烟叶中果胶合量，采用正交实验法考察了微紫青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ ｓｗ ０９）产果胶酶的加酶量、料液比、处理时间和温度４个因素对烟梗原料中果胶降解效果的影响。采用傅立叶变换红外光谱仪测定果胶的结构官能团，并采用在线裂解气相色谱／质谱法（ＰＹ／Ｇｃ－ｍｓ）研究了烟梗酶解前后在氦气中６００℃下的热裂解行为，并对其热裂解产物进行分析。结果表明，烟梗果胶降解最佳反应条件为：酶活力１４ ０００ ｕ／ｍ ｌ、料液比１∶５、反应温度５０℃、处理时间２ ｈ，果胶降解率达到最大４１．３５％。由红外光谱、热裂解对比可知，烟梗果胶酶解前后其结构官能团并未发生明显改变，但其中裂．．．

【目的】分离贮藏苹果中的展青霉素产生菌,并对其ITS序列进行分析鉴定。【方法】从贮藏库中苹果上分离展青霉素产生菌,采用真菌ITS区特异性引物对其ITS区进行PCR扩增测序,将分离菌ITS区序列与GenBank中的核酸数据库进行比对分析,确定展青霉素产生菌的生物学分类,并对其亲缘关系进行系统发育分析。【结果】共分离得到10株展青霉素产生菌,其中1号和8号菌株属曲霉属,其他8株属青霉属。在系统发育关系上,1号和8号菌为一个类群,其他8株菌属于一个类群。【结论】贮藏苹果中分离得到的10株展青霉素产生菌为青霉属或曲霉属菌株,它们之间存在着不同程度的亲缘关系。

【目的】对杨树腐烂病菌金黄壳囊孢胞外分泌复合体亚基CcExo70进行功能分析,探究其在杨树腐烂病菌生长发育及致病过程中的生物学功能,为深入了解杨树腐烂病菌致病机制以及制定病害防控策略提供科学依据。【方法】1)利用PCR技术克隆得到CcExo70基因的DNA序列; 2)通过生物信息软件对其编码的氨基酸序列进行特征分析并构建其同源基因的系统发育树; 3)通过PEG介导的遗传转化法得到CcExo70基因的敲除突变体及回补菌株; 4)通过PDA平板生长试验和PDB摇培试验,分析敲除CcExo70基因对该病菌生长发育、菌丝形态及H2O2胁迫响应的影响;通过对1年生欧美杨健康枝条烫伤接种的方法,测定CcExo70基因对该病菌致病性的影响; 5)利用荧光增白剂(CFW)、二氨基联苯胺(DAB)和FM4-64染剂探究各菌株中几丁质沉积、活性氧积累及内吞作用情况; 6)通过蛋白质组测序分析,筛选可能受CcExo70调控分泌的外泌蛋白。【结果】1)在杨树腐烂病菌中克隆得到了一个CcExo70基因,该基因全长1 992 bp,包含1个内含子,编码636个氨基酸。2)系统发育和序列比对分析表明,CcExo70与其他病原真菌的同源基因在进化上是高度保守的。3)利用遗传转化法筛选得到2个敲除突变体(ΔCcExo70-8、ΔCcExo70-9),并获得了回补菌株(ΔCcExo70/C)。4)表型分析发现,与野生型和回补菌株相比,CcExo70敲除突变体在菌丝生长、形态发生、氧化应激反应和致病力等方面存在显著的缺陷。5) CFW染色观察显示,野生型和回补菌株菌丝尖端存在明显的几丁质沉积,而敲除突变体菌丝尖端未见明显的几丁质沉积但菌丝隔膜异常增加。此外,共聚焦显微镜观察发现,与野生型和回补菌株相比,CcExo70敲除突变体的内吞作用显著延迟。6)蛋白组测序分析发现,8个候选的外泌蛋白在CcExo70敲除突变体胞外培养滤液中的含量显著低于在野生型胞外培养滤液中的含量(降低了50%以上),其中有4个候选的外泌蛋白(CcSP2、CcSP3、CcSP6、CcSP7)在胞外培养滤液中的含量显著高于其对应菌株的胞内含量,其中包括1个候选的效应分子(CcSP2)和2个糖苷水解酶(CcSP6和CcSP7),表明这4个外泌蛋白的分泌受到了CcExo70的调控。【结论】胞外分泌复合体亚基CcExo70在杨树腐烂病菌的生长、胁迫响应、内吞作用和致病性等方面起着重要的调控作用。