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[期刊] 中国水产科学
[作者]
张迪 杨铿 苏友禄 冯娟 郭志勋
青蟹呼肠孤病毒(mud crab reovirus,MCRV)和青蟹双顺反子病毒-1(mud crab dicistrovirus-1,MCDV-1)是从近年发生大规模死亡的养殖拟穴青蟹体内分离的、对青蟹具有致病性的两种病毒。它们常常同时存在,给青蟹养殖业带来巨大经济损失。在疾病的防治中,快速高效的病毒检测方法对疾病诊断以及及时采取有效地防治措施具有重要的意义。本研究利用MCRV和MCDV-1基因保守区设计4对引物,建立了可同时检测这两种病毒的双重巢式PCR(duplex-nested PCR)检测方法。研究发现该方法对两种病毒的检测限都可以达到10个拷贝,并与鲍肌肉萎缩病毒(AbSV)、虾类...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
储旭 房文红 刘志强 周俊芳 李信书 李新苍
青蟹呼肠孤病毒 (mud crab reovirus，MCRV)是养殖拟穴青蟹(Scylla paramamosain)致死率最高的病原之一，青蟹种蟹及其幼体携带该病原对青蟹养殖产业高质量发展造成了重大威胁。为从源头切断该病原的感染和传播，本研究研发了一种筛选无MCRV种蟹的荧光定量检测方法。为最大限度提高检测灵敏性，本研究首先分析了MCRV在感染青蟹主要组织中的含量，发现血淋巴中病毒载量最高；随后分析该病毒的13个预测基因在血淋巴中的表达水平，发现病毒VP11基因相对表达量最高；最后基于VP11基因序列保守区设计特异引物，建立了一种SYBR Green qRT-PCR (quantitative reverse-transcription PCR)检测方法，该方法可精确检测病毒下限为50 copies/反应。考虑到该检测方法还具有组织和靶标基因选择优势，其灵敏性显著高于早期报道的其他检测方法。使用该方法对含有5种常见甲壳动物病原的样品进行检测，均无特异性扩增。抽取微量血淋巴(大约50 μL/只)提取RNA，随后使用该检测方法对22只种蟹和20只市售青蟹进行MCRV检测，阳性率分别54.55%和85.00%。此外，利用该方法进一步分析了MCRV在较低温度下(21℃)在青蟹体内增殖情况，发现病毒感染早期呈指数方式增殖，随后进入平台期，实验周期内无青蟹死亡。总之，本研究建立了一种灵敏性高、实用性强的MCRV检测方法，其既可用于微创条件下无MCRV种蟹筛选，也能满足病原感染相关研究的需要。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
曾伟伟 王庆 王英英 张乐生 刘宝芹 石存斌 吴淑勤
针对草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)各类型毒株的保守区域分别设计3对引物,优化反应条件和体系,建立了草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法,通过PCR扩增分别获得大小约为530 bp、297 bp和196 bp的DNA片段。进一步分析表明,该检测方法具有良好的敏感性、特异性和稳定性,可以检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型核酸最低量分别约为260、190与230拷贝的病毒量,且某一类型的引物只能检测到同一类型的GCRV。用建立的多重RT-PCR方法对2008—2011年采集自江西、广东、湖北、浙江、重庆、四川、福建等地的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)主养区...
[期刊] 水产学报
[作者]
周勇 曾令兵 范玉顶 徐进 马杰 罗晓松 肖艺
利用RT-PCR技术扩增出草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白编码区长度为1 250 bp的片段,克隆到pEGFP-N1载体上,构建重组质粒pEGFP-N1-VP6。经PCR鉴定确认正确后,以10倍梯度稀释pEGFP-N1-VP6重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了草鱼呼肠孤病毒的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.998 09,斜率为-3.373;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×106copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出草鱼呼肠孤病毒,而对鲤春病毒血症病毒(SVCV...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
潘晓艺 刘杜鹃 沈锦玉 张宇飞 蔺凌云 王军毅 郝贵杰 姚嘉赟 徐洋 袁雪梅
罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)和双顺反子病毒(M.rosenbergii dicistrovirus,MrDV)是已报道对罗氏沼虾易感的主要致病性病毒,该研究通过建立双重RT-PCR方法对MrDV和MrNV两种病毒同时进行检测。根据MrDV和MrNV基因组序列的保守区分别设计特异性引物,并对双重PCR的退火温度和引物浓度进行优化,在获得优化反应体系和反应条件后,对罗氏沼虾样品进行检测。结果表明,双重PCR最佳退火温度为60℃,反应体系最佳引物终浓度MrNV384为0.1μmol/L,MrDV472为0.05μmol/L,对...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘宝芹 曾伟伟 王庆 张乐生 王英英 石存斌 吴淑勤
草鱼出血病是危害中国淡水养殖最为重要的病害之一,其病原为草鱼呼肠孤病毒(grass carp hemorrhagevirus,GCRV),其中,HZ08株是当前引起草鱼出血病的主要流行毒株。为建立一种快速、灵敏、特异的草鱼呼肠孤病毒主要流行株检测方法,本研究利用草鱼呼肠孤病毒HZ08株S7基因保守区,设计了一对能特异性扩增154 bp片段的引物和TaqMan探针,用含有S7基因全长的重组质粒PAVX1-S7作为标准品,构建质粒拷贝数与CT值的标准曲线,并对该方法的特异性、可重复性、敏感度进行评价。结果显示:标准曲线在6.0×1010～6.0拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
范玉顶 马杰 周勇 江南 刘文枝 曾令兵
根据Gen Bank登录的草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)不同基因型毒株编码VP2蛋白的S2节段保守序列,设计1对简并引物,通过优化反应条件及灵敏度和特异性评价,建立了一种能同时检测三种基因型GCRV的通用RT-PCR检测方法。结果显示:该方法在三种基因型GCRV中均扩增出大小约590 bp的特异性条带;灵敏度试验结果显示,该方法对于I、Ⅱ、Ⅲ型GCRV的检测限分别为380、250和380拷贝/μL。该方法可特异性地检测目前已知的三种基因型GCRV,而在大鲵虹彩病毒(GSIV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)和传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)中无扩增产物。利用该方法检测49份草鱼出血病疑似样品,结果显示均为GCRV阳性,其中I型阳性率为8. 2%,Ⅱ型阳性率为85. 7%,Ⅲ型阳性率为2%,I、Ⅱ型混合感染阳性率为4. 1%,其他类型的混合感染未检测到。结果表明,本研究建立的针对I、Ⅱ和Ⅲ型GCRV的RT-PCR检测方法具有通用性好、省时高效的突出特点,同时还兼具较高的灵敏度和特异性。
[期刊] 水产学报
[作者]
殷亮 王庆 曾伟伟 李永刚 王英英 刘春 梁红茹 石存斌 吴淑勤
为了建立和应用可检测基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的荧光定量检测方法,实验根据基因Ⅰ型GCRV的S6保守序列,分别设计扩增目的条带661 bp普通引物(P1、P2)、扩增目的条带159 bp荧光定量引物(F1、F2)和一条探针;同时构建含有目的片段的PVAX1-S6作为标准质粒,10倍梯度稀释构建质粒拷贝数与Ct值的标准曲线(Y=-3.389X+38.076)。结果表明,此方法在3.9×107~3.9×101拷贝/μL之间相关性较好,R2为0.992,最小检测量为4拷贝/μL;且与基因Ⅱ型、Ⅲ型GCRV以及其他病原核酸无交叉反应。运用该方法检测16份草鱼出血病疑似样品,阳性结果为4份;而普...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
熊娟 陈吉刚 杨季芳 陈孝煊
运用石蜡切片及超薄切片技术,对感染呼肠孤病毒的锯缘青蟹组织进行组织病理和超微观察。石蜡切片结果显示:SsRV的侵染导致青蟹的肝胰腺、鳃、肠、心、胃和肌肉组织中产生明显组织病理变化,其中以肝胰腺、鳃组织和肠组织的病理变化最为明显,主要包括肝胰腺基底膜破损、肝细胞坏死,鳃腔堵塞,肠上皮细胞脱落,心肌与足肌纤维排列紊乱、断裂等病理变化。超薄切片结果显示:SsRV在肝胰腺、鳃、肠、心等组织广泛分布,说明SsRV组织嗜性广泛;SsRV可导致靶器官细胞核染色质凝结、电子密度增高、髓样小体和溶酶体产生、线粒体组织结构破坏和粗面内质网扩张变形等明显细胞病理学变化。
关键词：
锯缘青蟹 呼肠孤病毒 组织病理 超微病理
[期刊] 西南农业学报
[作者]
秦春香 谢芝勋 谢丽基 刘加波 庞耀珊 邓显文 谢志勤
将纯化好的两个ARV结构蛋白σ3和σ2作为包被用抗原,分别进行间接ELISA,并确定它们的最佳抗原包被浓度分别为9.5、12.0μg/mL;一抗血清的稀释度为1∶200;HRP酶标羊抗鸡IgG稀释度为1∶5000,初步建立了能检测ARV抗体的σ3-ELISA、σ2-ELISA以及σ3、σ2两个蛋白同时包被的σ3-σ2-ELISA检测方法。分别用上述3种方法对制备的ARV SPF鸡阳性血清进行检测,结果阳性检出率分别为90.91%、69.70%和100%。表明σ3-σ2-ELISA方法在ARV抗体检测方面具有较高的敏感性。
关键词：
禽呼肠孤病毒 结构蛋白 间接ELISA
[期刊] 淡水渔业
[作者]
曾伟伟 王英英 尹纪元 汤亚方 李莹莹 王庆 高彩霞 任燕 刘春 石存斌
为了解决Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus genotypeⅡ,GCRV-Ⅱ)含量和滴度测定方法的选择问题,本研究利用荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)、免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)和间接免疫荧光试验(indirect fluorescent assay,IFA)三种方法来对GCRV-Ⅱ进行检测和含量测定,从特异性、敏感性、可靠性和检测结果的相关性来比较这三种方法对于GCRV-Ⅱ定量检测的差异。结果显示:qPCR、IPMA和IFA三种方法检测GCRV-Ⅱ的最低限分别为8.6、86和86拷贝/μL,qPCR的检测灵敏度比IPMA和IFA高一个数量级;特异性分析表明,qPCR、IPMA和IFA三种方法均只能检测出GCRV-Ⅱ型分离株,而其它病毒和未感染病毒的阴性对照细胞均为检测阴性,表明这三种方法均具有较高的特异性;3种方法分别检测60份已知临床样品,qPCR、IPMA和IFA的诊断敏感性和特异性分别为96.7%(29/30)和100%(30/30)、100%(30/30)和93.3%(28/30)及100%(30/30)和100%(30/30);三种方法对于GCRV-Ⅱ的定量检测结果中病毒拷贝数和病毒滴度之间具有较好的相关性,其拟合曲线分别为:Y(IPMA,TCID_(50)/mL)=23.629X-536 174(qPCR,拷贝/mL)(R~2=0.996)、Y(IFA,TCID_(50)/mL)=20.318X-575 062(qPCR,拷贝/mL)(R~2=0.995)和Y(IPMA,TCID_(50)/mL)=1.161X-1 176(IFA,TCID_(50)/mL)(R~2=0.999)。结果表明,GCRV-Ⅱ病毒滴度的测定,除了用IPMA和IFA外,也可以采用qPCR方法通过测定病毒的核酸拷贝数来测算其病毒滴度。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张金凤 曾令兵 张辉 周勇 肖艺 苏岚 高正勇
根据草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)衣壳蛋白VP6编码基因的序列设计特异性引物,以病毒全基因组RNA为模板,通过对反应条件进行优化,建立了GCRV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。检测结果表明,本方法可在63℃下1 h内实现靶片段的大量扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯型条带,反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色阳性结果明显区别于橙色阴性结果。该检测体系针对草鱼呼肠孤病毒的检测灵敏度高,其最低检测限为33 pg,与常规RT-PCR方法相比较,灵敏度高10倍,且与斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱...
[期刊] 水产学报
[作者]
罗明菊 李宁求 林强 牛银杰 刘礼辉 梁红茹 罗霞 付小哲
为有效预防大口黑鲈双RNA病毒(largemouth bass birnavirus, LBBV),实验针对LBBV保守基因VP1设计特异性引物,构建重组质粒pMD-LBBV-VP1,通过优化PCR反应条件,提高检测方法的灵敏度和特异性,建立了大口黑鲈双RNA病毒的巢式RTPCR检测方法,并采用该方法对实验室2017—2020年收集的304株样本进行检测。结果显示,巢氏引物F1/R1、F2/R2最佳工作浓度均为4×10~(-12) mol,最佳退火温度分别为64.1℃和61.5℃,当巢氏RT-PCR扩增35个循环时,可以检测质粒最低浓度为4.15个/μL拷贝数,最低模拟样品浓度为10~2 PFU/mL,与第1轮PCR相比,灵敏度均提高了10 000倍,同时检测9种不同病毒,仅LBBV出现明亮特异性条带,在304个样品中,第1轮PCR检出阳性样品14株,检出率为4.60%,巢式RT-PCR检出阳性样品28株,检出率为9.21%;本实验建立的巢式RT-PCR检测方法灵敏度高且特异性好,可用于LBBV的早期检测及防控。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张旻 林祥梅 江育林
蛙虹彩病毒属(Ranavirus)病毒宿主广泛,可以感染爬行类、鱼类和两栖类,大部分病毒对宿主都有较强的致病性和致死性。为建立一种快速高效的蛙虹彩病毒的检测方法,本研究利用中华鳖虹彩病毒(Soft-shelled Turtle Iridovirus,STIV)核衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)基因保守区设计内引物和外引物,建立了特异性检测流行性造血器官坏死病毒(Epizootic Haematopoietic Necrosis Virus,EHNV)、中华鳖虹彩病毒和虎纹蛙虹彩病毒(Tiger Frog Virus,TFV)的巢式PCR(巢式PCR)检测方法,并制备...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
张昭 朱四东 井晓欢 杨季芳 陈吉刚
锯缘青蟹呼肠孤病毒(Scylla serrata reovirus,SsRV)第9节段(S9)编码的p40蛋白可能为病毒的甲基转移酶(methyltransferase)。为了便于确认p40在病毒复制过程中扮演的角色,将S9片段的开放阅读框(ORF)克隆到原核表达载体pET28a(+),实现了在宿主表达菌E.coli BL21(DE3)中的高效表达,进而纯化了重组表达蛋白p40(rp40),并制备了抗SsRV p40蛋白的2株单克隆抗体(4B7、3E5)。经Western blot分析表明,2株单克隆抗体均可特异地识别rp40蛋白,以及识别SsRV病毒蛋白中分子量为46 ku和40 ku 2条...
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