根据NCBI已发表的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)促旋酶B亚单位基因gyrB和编码细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的保守序列设计引物,建立了一种快速检测青虾源维氏气单胞菌的双重PCR检测方法。结果显示:青虾源维氏气单胞菌gyrB和rpoD基因PCR扩增产物大小分别为815 bp、554 bp,而对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、非O1霍乱弧菌(non-O1 Vibrio cholerae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)扩增结果皆为阴性;灵敏性试验结果显示该方法检测到的最低菌体DNA量为1.8×10~(-2) ng/μL,且10份送检样本检测结果与传统细菌分离鉴定结果相一致。结果表明,双重PCR检测方法特异性好、灵敏性高,适用于青虾源维氏气单胞菌的快速检测。

针对GenBank中登录的气单胞菌属(Aeromonas)的毒力基因甘油磷脂胆固醇酰基转移酶基因(GCAT)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的16SrRNA基因的保守区设计2对特异性引物。通过进行双重PCR反应体系优化,PCR产物的测序鉴定和特异性试验,建立了一种能同时检测气单胞菌(Aeromonasspp.)和嗜水气单胞菌的双重PCR检测方法。用此方法对5株嗜水气单胞菌、7株其他不同种的气单胞菌和5株非气单胞菌属菌株进行双重PCR检测。结果显示,气单胞菌和嗜水气单胞菌在GCAT基因的扩增区都能得到有效扩增,其中嗜水气单胞菌能同时在16SrRNA基因扩增区得到有效扩增...

选取杀鲑气单胞菌A层A蛋白(VapA)保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针。以ATCC标准株10倍系列稀释,通过血球计数板计数后进行实时定量PCR,制作标准曲线。通过SDS软件获得细菌数量(X)与Ct值的关系为:Ct=-3.1574lgX+43.6841(相关系数R2=0.992)。实时定量PCR的检测限为6个细菌。建立的方法对杀鲑气单胞菌典型株和非典型株具有较好的特异性,与其他细菌没有交叉反应。杀鲑气单胞菌实时定量PCR方法的建立,对于快速口岸检疫、临床诊断和疫病监测具有重要的应用价值。

【目的】建立牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌的双重PCR检测方法。【方法】根据布鲁氏菌IS711序列和单增李斯特菌毒力因子HlyA序列设计并合成引物,建立双重PCR检测方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检测,并制备污染模型乳,通过直接检测、增菌后检测、细菌富集后增菌检测,确定最低检测限。【结果】建立了牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法,该方法特异性好、敏感性高、可重复性好。布鲁氏菌和单增李斯特菌单PCR检测最小DNA质量浓度分别为0.282和3.33 pg/μL,双重PCR检测最小DNA质量浓度分别为2.82和33.3 pg/μL。感染模型乳不经过增菌,布鲁氏菌和单增李斯特菌最低检测...

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是一种重要的鱼类致病菌，可以感染多种海淡水鱼类。杀鲑气单胞菌包括5个亚种，目前常用的生理生化特征和16S rDNA序列分析方法很难实现亚种的快速精确区分。为实现杀鲑气单胞菌亚种的快速鉴定和检测，针对我国常见的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A.salmonicida subsp. salmonicida)和杀日本鲑亚种(A.salmonicida subsp. masoucida)，本研究开发了其特异性的PCR检测方法。根据Gene Bank已公布的杀鲑气单胞菌基因组信息，选择杀鲑亚种phoB基因和杀日本鲑亚种LOC111476736基因作为目标基因，根据其序列设计特异性引物，进一步对PCR反应的退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg~(2+)浓度和酶浓度5个方面进行了优化，并测试了该方法的特异性、敏感性和应用效果。结果显示，2对引物分别可以扩增出杀鲑气单胞菌杀鲑亚种522 bp的phoB特异性基因片段和杀日本鲑亚种515 bp的LOC111476736特异性基因片段。杀鲑亚种特异性引物最适退火温度为64℃，10μmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO_4和1 U/μL KOD酶的最适添加量分别为1.5、2、1.5和0.5μL。杀日本鲑亚种特异性引物最适退火温度为64℃，10μmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO_4和1 U/μL KOD酶的最适添加量分别为0.75、1、1.5和0.5μL。以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)、杀鲑气单胞菌其他亚种等14种其他水产病原菌或常见环境菌为模板进行PCR检测，均无特异性条带。该方法对杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的检测灵敏度为12.8 CFU/反应(菌体)或17.6 fg/反应(DNA)，对杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的检测灵敏度为23.8 CFU/反应(菌体)或27.2 fg/反应(DNA)。利用杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种分别对大菱鲆(Scophthalmus maximus)进行人工感染实验，感染后取病鱼组织进行PCR检测，结果显示，本方法可以从感染后的大菱鲆中分别检测到相应病原。综上所述，本研究建立了杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的特异性PCR检测方法，该检测方法为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的流行病调查和快速诊断提供了支撑。

致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是近年中国各地大规模流行的淡水养殖鱼类暴发性疾病的主要病原,本研究针对GenBank中登录的致病性嗜水气单胞菌的气溶素基因(hlyA)、溶血素基因(aerA)以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA保守区设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,试图建立一种检测致病性嗜水气单胞菌的多重PCR检测方法。对8株嗜水气单胞菌、16株相关菌株进行多重PCR检测,结果显示,非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA和aerA,而致病性分离株则至少含有hlyA基因;对40份送检的...

粘附素(aha1)、气溶素(aerA)和细胞兴奋性肠毒素(alt)是气单胞菌的主要毒力因子。根据aha1、aerA和alt基因序列设计三对引物建立了可同时检测三种毒力基因的多重PCR方法(MPCR)。该方法扩增出气单胞菌的aha1大小为1087bp,aerA为721bp,alt为480bp,其敏感度为102CFU·mL-1。而对金黄色葡萄球菌、恶臭假单胞菌、拟态弧菌以及非致病性气单胞菌均未扩增出任何条带。用限制性内切酶EcoRⅤ、BamHⅠ和FbaⅠ分别酶切PCR扩增产物,均获得与预期一致的酶切图谱。用建立的MPCR对15株水生动物源气单胞菌安徽分离株进行毒力基因检测,结果显示在13株致病性气...

研究基于哈氏弧菌HSP60基因序列设计1对特异性引物,通过优化PCR条件,特异性及敏感性检测,建立了一套哈氏弧菌特异性PCR检测方法。结果表明,该PCR检测方法可使分离自患病南美白对虾的哈氏弧菌扩增出238 bp的HSP60基因片段,其他五种对照病原弧菌未扩增出任何条带;检测方法最低能检测出2.1 pg的哈氏弧菌基因组DNA。表明建立的哈氏弧菌PCR检测方法可用于该菌引起的水产动物疾病的快速诊断。

利用GyrB基因的特异性引物建立沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR检测方法。将已知浓度的气单胞菌菌液加入灭菌的沉积物样品中,作为模拟沉积物样品。通过选择和优化沉积物DNA提取方法、特异性引物、标准曲线模板,建立沉积环境中气单胞菌属细菌准确检验的实时荧光定量PCR方法,同时验证该方法的特异性、灵敏性、重复性。结果表明,采用改进的溶菌酶-SDS温和裂解法提取沉积物DNA,以扩增GyrB基因片段的IAF和IAR为特异性引物,并直接以模拟沉积物样品DNA为标准品构建标准曲线,可以建立适用于定量检测沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR方法。该方法可灵敏、特异、准确地定量检测刺参养殖池塘...

本研究检测了分离自发病大菱鲆、半滑舌鳎及鲤鱼的22株病原鳗弧菌(Vibrio anguillarum)毒力相关基因的携带情况,并建立了病原鳗弧菌的分子生物学检测方法。以PCR方法检测8个毒力相关基因的分布,结果显示,22株病原鳗弧菌均可扩增出6个基因(emp A、vah1、vah4、fla A、rtx A和ton B)目的条带,未扩增出vir A和ang M基因;针对vah4和rtx A设计引物进行双重PCR扩增,同一PCR反应体系可扩增出两条目的条带,灵敏度为2.4×103 CFU/ml,对照菌无任何扩增条带;以vah4设计引物进行LAMP扩增,病原鳗弧菌可扩增出阶梯状条带,呈现阳性反应,6...

本研究检测了分离自发病大菱鲆、半滑舌鳎及鲤鱼的２２株病原鳗弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）毒力相关基因的携带情况，并建立了病原鳗弧菌的分子生物学检测方法。以ＰＣｒ方法检测８个毒力相关基因的分布，结果显示，２２株病原鳗弧菌均可扩增出６个基因（ｅｍＰａ、Ｖａｈ１、Ｖａｈ４、ｆｌａａ、ｒｔｘａ和ｔｏｎｂ）目的条带，未扩增出Ｖｉｒａ和ａｎｇｍ基因；针对Ｖａｈ４和ｒｔｘａ设计引物进行双重ＰＣｒ扩增，同一ＰＣｒ反应体系可扩增出两条目的条带，灵敏度为２．４×１０３ Ｃｆｕ／ｍｌ，对照菌无任何扩增条带；以Ｖａｈ４设计引物进行ｌａｍＰ扩增，病原鳗弧菌可扩增出阶梯状条带，呈现阳性反应，６株对照菌无阶梯．．．

【目的】建立检测胞内劳森菌的SYBR Green Ⅰ realtime PCR方法，为猪增生性肠炎的准确诊断奠定基础。【方法】针对胞内劳森菌16S rDNA序列设计引物，扩增16s rDNA，构建pTLI16S重组质粒。以pTLI16S为模板建立检测胞内劳森菌的SYBR Green Ⅰ realtime PCR方法，检测其特异性、敏感性和重复性，并用该方法对51份疑似增生性肠炎病例进行检测。【结果】建立的SYBR Green Ⅰ realtime PCR方法特异性强，与大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和副猪嗜血杆菌等无交叉反应；在标准质粒含量为1.0×102～1.0×108拷贝/μL时，质粒...

【目的】建立检测胞内劳森菌的ＳＹＢＲ ＧＲｅｅｎⅠＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法，为猪增生性肠炎的准确诊断奠定基础。【方法】针对胞内劳森菌１６ＳＲＤｎａ序列设计引物，扩增１６ＳＲＤｎａ，构建Ｐｔ－ｌｉ－１６Ｓ重组质粒。以Ｐｔ－ｌｉ－１６Ｓ为模板建立检测胞内劳森菌的ＳＹＢＲ ＧＲｅｅｎⅠＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法，检测其特异性、敏感性和重复性，并用该方法对５１份疑似增生性肠炎病例进行检测。【结果】建立的ＳＹＢＲ ＧＲｅｅｎⅠＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法特异性强，与大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和副猪嗜血杆菌等无交叉反应；在标准质粒含量为１．０×１０２～１．０×１０８拷贝／μｌ时，质粒含．．．

根据哈维氏弧菌(Vibro harveyi)溶血素基因vhhP2的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测哈维氏弧菌的方法。构建含vhhP2基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR Green I实时定量PCR,在Tm为60℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个特异峰,扩增所得标准曲线为y=–3.331x+37.48,相关系数为0.998,扩增效率为1,最低可检测到7个拷贝。实验结果表明该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性,对哈维氏弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。

根据Ｇｅｎ Ｂａｎｋ中公布的虾肝肠胞虫（ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ ｈｅｐａｔｏｐｅｎａｅｉ）（ｅｈｐ）ＳＳＵ ｒ Ｄｎａ序列设计１对特异性引物，建立并优化了ｅｈｐ的ＳｙＢｒ Ｇｒｅｅｎ ｉ实时荧光定量ｐｃｒ（ｑ ｐｃｒ）检测方法。结果显示，该方法在６０℃的退火温度时扩增效果最好，产物的熔解曲线为１个单峰，构建的方法对８．３×１０１–８．３×１０８ ｃｏｐｉｅＳ／μｌ的ｅｈｐ ＳＳＵ ｒ Ｄｎａ片段的检测响应具有良好的线性关系，扩增产物阈值循环数（ｃｔ）与模板起始量的对数［ｌｏＧ（Ｓｑ）］的关系为ｃｔ＝–３．３６９ ｌｏＧ（Ｓｑ）＋３９．３６４（ｒ２＝０．９９２），扩增效率为９８．１％，检测．．．