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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李盼 支瑶 汪方奎 陈雯莉
CcmK2蛋白是集胞蓝细菌PCC 6803羧酶体外壳蛋白的主要组分,在羧酶体的组装与功能行使方面扮演重要角色。为解析其功能,本研究构建了原核表达载体pET28a-CcmK2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达带有6个组氨酸标签的CcmK2重组蛋白。通过金属亲和层析技术,将CcmK2重组蛋白纯化后免疫家兔,制备抗CcmK2多克隆抗体。基于Dot blot分析的结果显示:该多克隆抗体能够有效检测蓝细菌CcmK2蛋白;进一步的抗体特异性分析显示,CcmK2多克隆抗体与其他羧酶体外壳蛋白存在微弱的抗原抗体反
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李松柏 支瑶 李盼 汪方奎 陈雯莉
羧酶体是由致密的外壳蛋白包裹着核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶和碳酸苷酶形成的细胞内蛋白质小体,是蓝细菌二氧化碳固定的场所。为解析羧酶体在不同培养条件下的功能,本研究构建了原核表达载体pET28a-CcmK2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达带有组氨酸标签的CcmK2重组蛋白,制备了其多克隆抗体,探讨了不同质量浓度氯霉素对细胞内羧酶体数目和羧酶体相关蛋白丰度的影响。首先,确定了不同质量浓度的氯霉素对集胞蓝细菌PCC 6803生长的影响,发现5.0μg/mL氯霉素能够完全抑制菌株的生长,但是可以
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李东霞 王莉 陈雯莉
为研究Anabaena sp. PCC 7120中的细胞形态决定蛋白MreB的亚细胞定位和功能,构建了由mreB自身启动子驱动的mreB-gfp融合载体,通过接合转移的方法将其转化到野生型Anabaena sp. PCC 7120中,获得绿色荧光蛋白标记的MreB的鱼腥蓝细菌菌株,同时用MreB的抑制剂A22处理菌株。结果显示,MreB的亚细胞定位随着细胞周期的进程而发生变化,A22处理可导致MreB无法正确聚合定位。
[期刊] 水产学报
[作者]
冯军厂 常绪路 朱振祥 郭祥瑞 赵燕静 刘慧芬 张建新 聂国兴
为从蛋白质水平研究细胞因子在鲤体内免疫应答过程中的合成变化,本研究采用PCR技术克隆TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β基因含有部分抗原决定簇的片段,引入双酶切位点Bam HⅠ和HindⅢ后连接至p ET-32a/21a,构建相应的表达载体,制备多克隆抗体。采用ELISA检测抗体效价,并以此作为实验工具,检测经嗜水气单胞菌感染后鲤血清中炎性细胞因子的合成变化。结果显示,基因TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β融合蛋白分子量分别约为31.8、31.7、35.3、32.5、18.0和33.6 ku;抗体效价达到2.4×106;在病原菌感染后的不同阶段,促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和抗炎细胞因子IL-10、TGF-β呈现出不同的合成变化。研究表明,制备的抗体具有较高的效价、亲和力和特异性,可用于鲤细胞因子的定量研究,该抗体的获得为鲤免疫应答与细胞因子合成的系统研究奠定了基础。同时,获取的鲤细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β的抗体亦可用于其他鱼类细胞因子蛋白质水平的定量研究。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
孙盛明 戈贤平 傅洪拓 朱健 张世勇 乔慧
应用RACE技术克隆了青虾(Macrobrachium nipponense)的Hc基因全长cDNA序列,并对该基因序列特征进行了分析。青虾Hc基因cDNA全长2 235 bp,包括10 bp的5′末端非翻译区(UTR),2 074 bp的开放阅读框(ORF),151 bp的3′UTR,开放阅读框编码688个氨基酸。蛋白相似度比对显示,青虾血蓝蛋白含有典型的6个保守的铜离子结合位点。系统进化树分析表明,青虾Hc与脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)Hc聚在一起,具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示,Hc基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量在肝胰腺中最高;使用荧光定...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李敏 徐韶足 陈雯莉 王莉
为寻找新型生物吸附剂用于重金属污染环境的修复,本研究通过设置不同时间、质量浓度以及氮源缺乏等条件,检测了鱼腥蓝细菌PCC 7120对Mn(2+)的吸附情况。结果表明:在Mn(2+)质量浓度低于10mg/L时,PCC 7120对Mn(2+)的去除率最高能达到80%,并且PCC 7120对Mn(2+)的吸附过程符合Freundlich等温吸附模型和准二级吸附动力学方程。缺氮后,PCC 7120对Mn(2+)的耐受力降低且吸附能力大大减弱。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王静 张巨源 王莉 陈雯莉
鱼腥蓝细菌PCC 7120中已有较为成熟的诱导表达系统,但缺乏可控的蛋白降解系统。本研究基于Mesoplasma florum中的Lon蛋白酶(mf-Lon),在蓝细菌中建立可诱导的蛋白降解系统,并通过该系统对关键基因编码产物进行可控降解以研究其生理功能。结果发现降解系统并无预期作用,需进一步改进。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
马跃 王建珏 黄江涛 张天颖 史怀平
【目的】原核表达奶山羊表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)蛋白胞外区25-644位共620个氨基酸序列(ECD序列),纯化蛋白并免疫家兔,制备针对山羊EGFR蛋白的特异性多克隆抗体,为山羊EGFR蛋白功能研究奠定基础。【方法】以pMD19-T-EGFR为模板,采用PCR方法扩增得到EGFR胞外区(ECD)基因序列。将ECD序列连接pET-32a(+)质粒构建pET-32a(+)-ECD原核表达载体,将该重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
陈春琳 刘祥 俱雄
【目的】构建溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核表达载体,优化OmpK蛋白的诱导表达条件,制备OmpK蛋白小鼠多克隆抗体。【方法】通过PCR扩增获得ompK基因,连接pET-32a质粒构建OmpK-pET32a载体,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达。利用切胶纯化获得OmpK蛋白后,免疫小鼠制备OmpK蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western-Blotting法检测抗血清特异性。通过正交试验,获得OmpK菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。【结果】PCR扩增获得了长816bp的ompK基因;成功构建了OmpK-pET32a载体,其诱导表达产物分子质量为30ku,与预期结果一致。E...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
刘祥
Ｏｍｐ Ｕ蛋白为溶藻弧菌主要外膜蛋白，具有很好的免疫原性，在疫苗上有很好的应用前景。本试验通过分子克隆获得Ｏｍｐ Ｕ蛋白的表达菌株，利用切胶纯化获得Ｏｍｐ Ｕ蛋白，免疫小鼠制备多克隆抗体，采用ＥＬＩＳＡ法检测抗体滴度为１∶３２００倍，ＷＥＳｔＥｒｎＢＬＯｔｔＩｎｇ法检测抗血清特异性较好。通过正交试验，获得Ｏｍｐ Ｕ菌株的最佳表达条件为：诱导时菌液ＯＤ６００值１，加Ｉｐｔｇ终浓度０．１ｍｍＯＬ／Ｌ，诱导时间８ ｈ，温度３２℃；最佳培养条件为：葡萄糖浓度０．４％，转速２３０ ｒ／ｍＩｎ，装液量５０ ｍ Ｌ。为Ｏｍｐ Ｕ工业发酵、蛋白功能与疫苗开发研究奠定基础。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
刘祥 俱雄 陈春琳
通过分子克隆,获得了Omp T蛋白的表达菌株;利用切胶纯化,获得了Omp T蛋白。用Omp T蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体滴度为1∶1 600,用Western Blotting法检测抗血清特异性较好。采用正交试验,获得Omp T菌株的适宜表达条件为诱导菌液OD600 nm为1.0,IPTG添加终浓度为0.3 mmol/L,诱导时间为8 h,诱导温度32℃;适宜培养条件为葡萄糖质量分数0%,转速230 r/min,装液量50 m L。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
苏 波 陈雯莉 王 莉
为明确鱼腥蓝细菌PCC 7120中sigC（all1692）基因与异形胞分化的关系，通过同源重组构建了sigC的缺失突变体MsigC和互补菌株，对其进行表型分析。结果表明，在缺乏化合态氮源时，MsigC的异形胞分化频率显著低于野生型,而在互补菌株CsigC中，异源表达的sigC可以互补突变体异形胞分化频率降低的表型。表明sigC参与异形胞分化的调控。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
苏波 陈雯莉 王莉
为明确鱼腥蓝细菌PCC 7120中sigC(all1692)基因与异形胞分化的关系,通过同源重组构建了sigC的缺失突变体MsigC和互补菌株,对其进行表型分析。结果表明,在缺乏化合态氮源时,MsigC的异形胞分化频率显著低于野生型,而在互补菌株CsigC中,异源表达的sigC可以互补突变体异形胞分化频率降低的表型。表明sigC参与异形胞分化的调控。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李之萌 王莉 陈雯莉
在鱼腥蓝细菌PCC 7120中,all3555是一个乙酰羟酸合成酶的编码基因,为研究该基因在鱼腥蓝细菌PCC 7120的生长和环境适应过程中的作用,构建了该基因的超表达和缺失突变菌株,结果显示该基因缺失后鱼腥蓝细菌PCC 7120仍可继续生长,但对NaCl胁迫的敏感性有一定程度提高,而超表达该基因则会提高鱼腥蓝细菌PCC 7120对氧化胁迫和NaCl胁迫的抗性,表明all3555对鱼腥蓝细菌PCC 7120的正常生长影响较小,但对菌株的抗氧化胁迫和抗NaCl胁迫等有重要作用。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
郭晓 汪远 范红结 马喆
[目的]本试验旨在制备抗鼠伤寒沙门菌Pag C蛋白的单克隆抗体并初步分析其特异性和识别的抗原表位,为沙门菌抗体阻断ELISA检测方法的建立奠定基础。[方法]原核表达并纯化Pag C蛋白,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体;用生物信息学分析法获得Pag C蛋白在沙门菌属内保守的区段,合成相应多肽P1及P2用于单克隆抗体筛选和结合表位鉴定;最后采用免疫印迹方法对单克隆抗体与肠杆菌科其他细菌的交叉反应进行检测,评价其特异性。[结果]纯化后的Pag C蛋白相对分子质量约23×103;免疫小鼠后经2次亚克隆最终得到稳定分泌抗体的细胞株6株,标记为A、B、C、D、I、J;单克隆抗体的反应性试验结果显示6株单克隆抗体均能够识别Pag C蛋白;单克隆抗体的结合表位分析显示,J细胞株分泌的单克隆抗体可特异性识别P1序列;采用免疫印迹方法对J细胞株上清液进行特异性检测,证实该株单克隆抗体与变形杆菌、大肠杆菌O1和宋内志贺菌Pag C蛋白均无结合反应。[结论]成功获得1株与Pag C蛋白有良好结合活性且具有高度特异性的单克隆抗体,该株单克隆抗体的识别表位位于Pag C中沙门菌属内保守区段,可作为建立沙门菌抗体阻断ELISA检测方法的候选单克隆抗体。
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