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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
屈雷 雷安民 闫海龙 于鸿浩 袁超 王磊 白丁平 陈生会 冯平 马晓玲 高晔 陈玉林
【目的】利用体细胞核移植技术克隆陕北白绒山羊优秀种公羊个体。【方法】以特别优秀成年陕北白绒山羊种公羊耳部皮肤成纤维细胞为供体细胞,体外培养成熟的陕北白绒山羊卵母细胞作为受体,利用显微操作方法对成熟卵母细胞进行去核操作,然后将供体细胞注射到其卵周隙内,经电融合将其导入去核卵母细胞内形成核移植重组胚。利用钙离子载体Ionomycine联合蛋白酶抑制剂6-甲基氨基嘌呤(6-DMAP)对核移植重组胚进行激活处理,挑选激活后完整的胚胎继续进行体外培养,然后在2～16细胞期时将克隆胚胎移植到相应的同期发情受体母羊体内,利用PCR-RFLP技术鉴定克隆羊。【结果】构建了体细胞核移植胚胎253枚,重组胚胎的融...
关键词：
体细胞克隆 核移植 陕北白绒山羊
[期刊] 中国农业科学
[作者]
敬晓棋 雷安民 屈雷 窦忠英
【目的】通过对正常受精胚胎、山羊同克隆胚胎(山羊去核卵与布尔山羊耳皮肤成纤维细胞重组)以及牛-山羊异种克隆胚胎(山羊去核卵与布尔山羊耳皮肤成纤维细胞重组)中线粒体超微结构的观察与比对,从亚细胞水平揭示异种克隆胚胎出现异常的原因,为异种克隆技术的进一步研究提供新思路。【方法】利用透射电镜分别对山羊正常受精胚胎、山羊同种克隆胚胎及牛-山羊异种克隆胚胎的原核、2-细胞、4-细胞、8-细胞及桑椹胚阶段的早期胚胎进行线粒体超微结构观察。【结果】山羊自然受精胚胎、山羊同种克隆胚胎的线粒体均为帽状,随着胚胎的发育,线粒体由电子密度高、嵴少的未成熟状态发育为电子密度低、嵴丰富的成熟线粒体,而牛-山羊异种克隆胚...
关键词：
牛 山羊 异种克隆 超微结构 线粒体
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
白丁平 陈静 谢璐娜 刘敏 陈玉林
以陕北白绒山羊毛囊生长期皮肤组织cDNA为模板,扩增出Lhx2基因的CDS区,成功构建了以KAP6.1为启动子表达Lhx2基因的绿色荧光表达载体pIRES2-KAP-LHX-EGFP.并利用脂质体介导转染绒山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得了稳定转染的细胞系,经PCR检测显示外源基因已整合到细胞基因中.研究结果为进一步开展Lhx2基因对绒山羊毛囊发育的影响和转Lhx2基因绒山羊的生产提供了前期研究基础.
[期刊] 中国农业科学
[作者]
金梅 白雪 张巍 高文波 王薇
【目的】研究产绒量居全国第一的中国特有种质资源-辽宁新品系绒山羊和产绒质量居全国第一的内蒙古阿尔巴斯绒山羊系统发生地位。【方法】通过PCR方法,对两种绒山羊16个个体的细胞色素b核苷酸同源区进行序列的测定,并进行比较分析。【结果】序列分析结果表明,序列全长为1140bp,定义了11种单倍型,单倍型比例为68.75%,说明辽宁新品系绒山羊和内蒙古阿尔巴斯绒山羊的遗传多态性比较丰富。利用分子钟,计算物种的分歧时间,绒山羊与山羊属其它山羊的分歧的时间大约是0.4万年,山羊属和岩羊属的分歧时间大约是3～6百万年,山羊属与绵羊属的分歧时间大约是4～7百万年。【结论】本试验成功地测定和分析两种绒山羊的细胞...
关键词：
绒山羊 细胞色素b 分子钟 系统起源
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王彦凤 梁燕 金永 王晓晶 郭旭东 王玮 王潇 王志钢 刘东军
【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosinbeta4,Tβ4)基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142bp,其中包含135bp的完整...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王志钢 其布日 包婵婵 旭日干
【目的】克隆内蒙古白绒山羊乳酸脱氢酶A(LDH-A)基因并分析其基本表达模式。【方法】采用RT-PCR和3′RACE技术克隆基因,将得到的基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。利用RT-PCR方法进行组织表达检测。【结果】获得了内蒙古白绒山羊LDH-A基因全长cDNA序列。该基因cDNA全长1 649 bp,包含一个996 bp的ORF和642 bp的3′UTR。SMART分析表明ORF编码的蛋白质具有Ldh_1_N domain和Ldh_1_C domain,Psite分析表明有L-乳酸脱氢酶活性位点,PSORT程序分析将其定位于细胞质中。LDH-A基因在脾、肾、睾丸和肌肉...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赛务加甫 张立 杨丽 彭新荣 郭志林 李向臣 权富生 安志兴 郑月茂 赵雪 张涌
以山羊皮肤成纤维细胞为供体细胞,绵羊去核卵母细胞为受体细胞进行种间体细胞核移植,构建山羊-绵羊重构胚,并对其采用离子霉素联合6-DM AP法和胞质注射绵羊精子提取物法进行激活,比较两种不同激活方法对山羊-绵羊种间体细胞核移植重构胚的激活效果。结果表明,共构建获得山羊-绵羊重构胚238枚,重构胚在体外能够发育至囊胚阶段;离子霉素联合6-DM AP法激活的卵裂率为58.33%(70/120),囊胚发育率为4.28%(3/70);胞质注射绵羊精子提取物法激活的卵裂率为63.55%(75/118),囊胚发育率为6.66%(5/75),两种方法的激活效果差异不显著。
关键词：
异种核移植 成纤维细胞 激活 山羊 绵羊
[期刊] 华北农学报
[作者]
耿荣庆 陈玉林 王兰萍 杨朝霞 姜维 刘敏 曹春娜
对绒山羊和绵羊KAP1.4基因的编码区进行克隆与分析,在此基础上预测了KAP1.4蛋白的分子结构,为研究毛(绒)用性状的分子基础提供资料。结果表明,克隆测序获得绒山羊、绵羊KAP1.4基因编码区序列长度为579bp和549 bp,分别编码192个氨基酸和182个氨基酸。生物信息学分析表明,绒山羊和绵羊KAP1.4蛋白的基本理化特性方面无明显差异,属于非跨膜蛋白,信号肽的长度和裂解点相同,都具有1个蛋白激酶C磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和6个N端酰基化位点;蛋白的二级结构由β折叠、β转角和无规则卷曲构成。三级结构预测显示,绒山羊与绵羊KAP1.4蛋白在空间三维结构上存在显著差异,将会进...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
潘晓燕 于永生 刘晓辉 王正朝 王晓阳 朴庆林 张立春 金海国
【目的】利用体细胞核移植技术制备转毛角蛋白Ⅱ型中间丝K2.9基因的高绒质绒山羊胚胎,为绒山羊优良品种的培育提供一种全新的技术材料。【方法】以含有Neor基因标记的K2.9毛囊特异表达载体pcDNA3.1-K转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得转K2.9基因细胞,将获得的转基因阳性细胞与体外成熟的绒山羊卵母细胞进行核移植,并对生产的重构胚进行了体外培养。本文分别进行了激活方法、供体细胞和卵母细胞来源的筛选,且对获得的囊胚进行了PCR鉴定。【结果】(1)Iono+6-D对成年羊卵母细胞的孤雌激活效果好于A23187+6-D,显著提高了胚胎的卵裂率。(2)羔羊孤雌胚的卵裂率显著低于成年羊,但...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李华 苏立宁 刘东军 李雪峰 旭日干
【目的】克隆内蒙古绒山羊视黄酸结合蛋白Ⅰ(cellular retinoic acid binding proteinⅠ,CRABPⅠ)基因的cDNA,进行蛋白结构的预测和表达分析,为绒山羊毛和绒形成的分子机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆内蒙古绒山羊CRABPⅠ基因序列,利用生物信息学方法预测其蛋白结构,采用实时荧光定量PCR探讨该基因在绒山羊4个胎儿日龄皮肤中的表达。【结果】内蒙古绒山羊CRABP I基因cDNA长679 bp(JN936490),其开放阅读框为414 bp,氨基酸序列与其它物种相比具有较高的序列相似性。CRABPⅠ蛋白无明显的信号肽和跨膜区域,不存在N糖基化位...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
杨娇馥 史偈君 梁燕 郑旭 张涛 秦毅 王志钢 刘东军
【目的】克隆内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA并分析其基本表达模式。【方法】RT-PCR克隆AKT基因cDNA。通过在线软件BLAST进行核酸序列分析,用SMART与Psite进行氨基酸序列分析。半定量RT-PCR检测AKT基因在绒山羊组织中的表达特异性。Western blotting检测绒山羊胎儿成纤维细胞中AKT表达。【结果】克隆到的内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA片段长1 443 bp,包含了编码480个氨基酸残基的全长ORF,氨基酸序列与绵羊(NM_001161857.1)同源性为97%。SMART分析表明,ORF编码的蛋白包含了可与3-磷酸肌醇结合的PH结构域及具有丝氨酸/苏氨酸激酶...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
温玉玲 王玉俭 吴玲燕 严若峰 徐立新 宋小凯 李祥瑞
目的]本文旨在探讨捻转血矛线虫苏氨酸醛缩酶结构域包含蛋白(TA-1)体外对山羊外周血单个核细胞(PBMC)功能的影响。[方法]根据TA-1基因序列设计引物进行PCR,将所得目的片段克隆到pMD19-T载体进行测序和分析;将该片段亚克隆到pET-32a(+)载体中构建表达质粒pE T-32a/TA-1。重组子用IPTG诱导后用SDS-PAGE观察其表达情况,对重组蛋白(rT A-1)纯化、连续浓度梯度递减的尿素溶液透析复性。从健康山羊采集的血液分离获得的PBMC与rT A-1(10μg·mL(-1))共孵育
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张艳丽 钟部帅 樊懿萱 周峥嵘 王子玉 应诗家 郭蓉 王锋
本研究以山羊睾丸组织为材料,用RT-PCR法成功克隆了山羊DAZL基因的cDNA序列950 bp,测序和生物信息学分析表明,其含有885 bp的完整开放阅读框(ORF),编码295个氨基酸,与牛的氨基酸序列同源性为97.97%,编码产物含有典型的RNA识别基序RRM和DAZ重复基序;将山羊DAZL基因亚克隆至表达载体pEGFP-C1上,构建了山羊DAZL基因真核表达载体pEGFP-DAZL,采用脂质体法将其瞬时转染至山羊骨髓间充质干细胞(BMSC)中,通过荧光显微镜观察确定重组质粒在山羊BMSC内的表达和定位。
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵越 林亚秋 朱江江 林森 池永东 刘鲁蜀 王永
旨在克隆山羊Kruppel样转录因子9(Kruppel-like factor 9,KLF9),阐明其在山羊各组织及其脂肪细胞中的表达模式,为深入探究KLF9基因对山羊肌内脂肪(Intramuscular fat,IMF)沉积的调控作用奠定理论基础。利用胶原酶消化法获得7日龄简州大耳羊羔羊肌内前体脂肪细胞。选成年简州大耳羊与藏山羊各4只,用RT-PCR法克隆山羊KLF9基因,用实时荧光定量PCR方法检测KLF9基因在山羊背最长肌、股二头肌、臂三头肌、皮下脂肪、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织中的相对表达水
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘通 王恒 李运生 张运海
为研究克隆黄淮白山羊耳部皮肤成纤维细胞(cGSF)的体外培养及其生物学特性。通过组织块接种培养法和胰蛋白酶消化法均可以获得原代cGSF,但在接种培养24 h后,组织块法收获的细胞贴壁率和细胞量要明显高于胰酶消化法。就生长特征而言,cGSF的生长曲线也呈现典型"S"型,到达指数增长期、平台期的时间分别为第3,6天,早于普通黄淮白山羊的皮肤成纤维细胞(GSF),后者分别为第4,8天。cGSF原代(P0)、第2代(P2)、第8代(P8)细胞的染色体数目异常率均高于相同代数的GSF。在相同转染条件下,cGSF在转染p EGFP-N1后,再经G418筛选亦可形成克隆点,扩增获得阳性细胞系。总之,源自克隆...
关键词：
体细胞克隆 山羊 成纤维细胞 生物学特性
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