【目的】从陆地棉中克隆GhNAC7,分析其结构和功能,研究其在棉花不同组织中以及叶片不同发育时期的表达量。并转入拟南芥进一步探究其在棉花叶片衰老过程中的作用。【方法】利用中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室建立的棉花衰老叶片cDNA文库中的序列,获得1个含有NAM结构域的EST,使用Oligo6.71设计引物,重新在陆地棉叶片cDNA中进行克隆。使用Gene Structure Display Server软件分析GhNAC7结构,使用在线工具Plant CARE分析启动子序列,利用在线工具G

结合ＲＡＣＥ技术与ｈｉ－ＴＡｉＬ ＰＣＲ技术克隆得到１个新的棉花ｂＺｉＰ转录因子的ＣＤＮＡ序列，暂命名为ＧｈｂＺｉＰ１。该基因包含１个完整的包含４７１ｂＰ的开放阅读框，编码１５６个氨基酸。ＧｈｂＺｉＰ１蛋白具有典型的ｂＺｉＰ保守结构域，与拟南芥等植物ｂＺｉＰ１蛋白的保守区相似性较高，推测棉花ＧｈｂＺｉＰ１与拟南芥ＡＴｂＺｉＰ１功能类似。此外，ｑＰＣＲ分析表明ＧｈｂＺｉＰ１基因在＂洞Ａ＂可育株花药的４个主要时期（小孢子单核早期、小孢子单核期、双核期及花粉形成期）的表达均明显高于不育株。由此提示，ＧｈｂＺｉＰ１基因可能与棉花雄性不育相关。

[目的]本文旨在克隆陆地棉U-box E3泛素连接酶基因GhPUB19D并分析其在抵御生物和非生物胁迫中的功能及其作用机制。[方法]利用PCR从棉花cDNA文库中扩增盐胁迫和大丽轮枝菌处理均上调表达的GhPUB19D全长cDNA;qRT-PCR分析GhPUB19D的组织表达特征及其对不同非生物胁迫处理的响应;构建pBIN-GhPUB19D-GFP载体并导入烟草叶片中,分析GhPUB19D的亚细胞定位;利用病毒介导的基因沉默(VIGS)和转基因过表达GhPUB19D基因分析该基因对植物的耐盐性和抗病性的影响。[结果]GhPUB19D基因ORF全长2 043 bp,编码680个氨基酸,其编码的蛋白质含有1个U-Box和3个ARM结构域,定位于高尔基体。GhPUB19D基因启动子区存在多种逆境胁迫响应顺式作用元件。GhPUB19D在棉花根和叶片中优势表达。聚乙二醇(PEG)、NaCl、脱落酸(ABA)、乙烯(ET)、水杨酸(SA)、赤霉素(GA3)处理后,均可诱导GhPUB19D在1 h达到表达峰值。VIGS沉默GhPUB19D棉花在接种大丽轮枝菌Vd991之后,叶片黄化和枯萎较正常植物更为严重,植株发病率和病情指数均极显著增加。转GhPUB19D基因可以提高拟南芥在ABA处理下的种子萌发率,但不能减轻ABA对幼苗生长的抑制作用;转GhPUB19D基因可以提高拟南芥幼苗的耐盐性,ABA的SnRK2.3/2.6信号通路下游的AtABF3和AtABF4对盐胁迫的响应增强,而AtRD26、AtMYB44、AtRAB18、SLAH3等对盐胁迫的响应减弱。转GhPUB19D基因可以显著减轻大丽轮枝菌病症,显著降低拟南芥植株中大丽轮枝菌含量,提高AtPR1、AtPR2、AtPR3、AtPR4、AtPR5、AtNPR1等系统获得抗性相关基因的表达及其对大丽轮枝菌的响应。[结论]过量表达GhPUB19D可显著提高植物的耐盐性和黄萎病抗性。

【目的】MYB基因家族作为植物中最大的转录因子家族之一，在抵御逆境胁迫中发挥着重要的作用。克隆陆地棉MYB转录因子基因GhMYB108，并进行表达分析，验证其在干旱胁迫响应中的作用，为进一步研究GhMYB108调控陆地棉耐旱的分子机制奠定基础。【方法】根据干旱转录组数据分析，确定GhMYB108为干旱响应基因；运用聚合酶链式反应（PCR）从陆地棉根系cDNA中扩增目的基因；对GhMYB108进行基因结构特征、预测基因序列信息以及系统进化关系等生物信息学分析；利用Plant Care网站对获得的基因启动子序列进行分析；在不同逆境胁迫条件下，对GhMYB108的表达特性进行qRT-PCR分析；通过亚细胞定位确定GhMYB108蛋白在细胞中的位置；利用酵母试验验证其转录活性；使用病毒诱导的基因沉默技术（virus induced gene silencing,VIGS）沉默GhMYB108，并用qRT-PCR检测基因沉默效率。观察沉默株系在干旱处理前后的表型变化，并统计存活率，采用试剂盒测定相关生理生化指标；通过对棉花叶片喷施ABA与氟啶酮试验来分析GhMYB108与ABA的关系。【结果】从陆地棉中克隆了GhMYB108(Gh＿A10G1563），其全长879 bp，编码292个氨基酸，其蛋白质相对分子量为33.288 kD，等电点为6.037，多重序列比对和保守结构域分析，发现GhMYB108含有2个高度保守的MYB结合结构域，属于典型的R2R3型MYB转录因子。不同物种亲缘关系分析发现，GhMYB108与AtMYB108、AtMYB78和AtMYB2的同源性较高，属于同一亚族，且已有研究发现AtMYB108、AtMYB78和AtMYB2与干旱或ABA信号通路相关。GhMYB108定位于细胞核，且具有转录激活活性。在干旱和对照植株中，GhMYB108均在根中表达量最高，茎中表达量最低，并且受自然干旱、18%PEG 6000模拟干旱、盐胁迫和低温等非生物胁迫诱导表达。GhMYB108沉默之后，在自然干旱条件下，沉默植株出现临界表型，与对照相比，其萎蔫更严重，且存活率降低，一些生理生化指标也发生显著变化，如叶片失水率加快，丙二醛含量升高，叶片相对含水量和脯氨酸含量减少，过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性降低，且通过DAB与NBT染色发现植物体积累了更多过氧化氢（H_2O_2）和超氧阴离子（O_2~-）。通过对棉花叶片喷施激素ABA或氟啶酮发现GhMYB108可受ABA信号的正调控。【结论】GhMYB108正调控棉花抗旱性，且受ABA信号的正调控。

为防止棉铃脱落提高结铃性,进而提高棉花产量,从陆地棉中分离出一个参与离层分化调控的相关基因GhBOP1。通过生物信息学分析,表明GhBOP1蛋白序列含有保守性强的BTB和ANK结构域;进化树分析显示该蛋白氨基酸序列与许多植物的同源蛋白相似程度很高,说明该类蛋白进化较慢。利用qRT-PCR进行组织特异性表达分析的结果表明,GhBOP1基因在根、茎、叶和花等组织器官中均有少量表达,但在离层中为优势表达,表达量为叶片表达水平的20倍。利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术干涉棉花GhBOP1基因的表达,同时进行低盐胁迫处理分析,对照植株叶片出现大量地脱落,而GhBOP1基因沉默植株叶片生长正常。总之G...

Dirigent-like基因(DIR)编码蛋白质参与木质素的形成,与植物体的病菌防御有关。本研究以抑制差减杂交(SSH)技术获得DIR的EST为信息探针,对棉花EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了全长为768 bp的DIR基因cDNA全长,将该基因命名为GhDIR。该基因序列的开放阅读框(ORF)位于70～594 bp,推测编码175个氨基酸残基的蛋白。用陆地棉基因组DNA和cDNA分别进行了PCR扩增验证,克隆测序结果表明,所得GhDIR序列与电子克隆序列完全一致,没有内含子。序列比对和系统进化分析表明,该基因与海岛棉的同源序列表现了最高的相似性,与其他双子叶植物同源序列的相似性次之...

为了研究棉花中AOP2-like(GhAOP2-like)与抗旱耐盐的相关性，根据河北省农林科学院棉花研究所遗传育种研究室前期获得的蛋白质组数据，利用同源克隆法得到了GhAOP2-like的基因序列，用生物信息学方法对GhAOP2-like蛋白的理化性质、结构、亚细胞定位等进行了分析，利用qRT-PCR技术检测了GhAOP2-like的组织特异性表达以及在干旱、盐和激素处理下的表达量变化。结果显示，GhAOP2-like位于D13染色体上，CDS序列长972 bp,编码323个氨基酸。生物信息学分析发现，GhAOP2-like蛋白的分子式为C_(1654)H_(2525)N_(429)O_(478)S_(19),理论等电点为5.20,不含信号肽和跨膜结构域，定位于细胞质中。聚类分析结果显示，棉花与其他物种中的AOP序列被明显分成2组，但与木槿中AOP序列关系最近。根据qRT-PCR的结果，发现GhAOP2-like在根、茎、叶和发育中的种子中都表达，但在根中表达量最高，并且在干旱、盐、GA_3、MeJA和ABA处理下上调表达，但在MeJA处理下表达变化最强烈，说明GhAOP2-like可能通过参与茉莉酸信号通路调节根系的生长从而提高陆地棉的抗逆性。

【目的】研究GhUGT76C1基因调控陆地棉株高的生物学功能。【方法】以陆地棉矮化突变体LA-1为材料，克隆GhUGT76C1基因，并对克隆片段进行生物信息学及进化分析。构建过量表达载体，利用农杆菌介导法转化拟南芥获得过量表达转基因株系。通过不同光质光强处理条件下转基因株系表型鉴定分析GhUGT76C1基因在调控LA-1矮化中发挥的功能。【结果】成功克隆了陆地棉GhUGT76C1基因。GhUGT76C1基因全长1447 bp，cds序列长1365 bp，编码454个氨基酸，理论分子量为 51.31 kD，等电点为5.40，编码不稳定疏水性蛋白。GhUGT76C1蛋白的二级结构含有10个α螺旋，17个β片层区，22个转角，22个无规则卷区。系统进化树分析发现，GhUGT76C1蛋白与拟南芥同源蛋白的亲缘关系最近。成功构建陆地棉GhUGT76C1基因过量表达载体，并转化拟南芥获得过量表达转基因株系。表型分析发现，在黑暗、低光强蓝光及远红光条件下过量表达株系均出现显著的下胚轴增长的表型。【结论】首次成功克隆了陆地棉GhUGT76C1基因，并初步解析了其调控株高的功能，为深入了解陆地棉高度的调控机理提供研究材料。

为研究转录因子ＧｈＷＲＫＹ４１在陆地棉盐胁迫应答过程中的作用，基于差减文库分析结果，利用ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＡＣＥ技术，克隆了ＧｈＷＲＫＹ４１基因（ＧＥｎＢＡｎＫ登录号为ｈＭ００２６３５）。该基因ＣＤｎＡ长度为１ ６３０ＢＰ，含有ＯＲＦ（ＯＰＥｎ ＲＥＡＤｉｎＧ ＦＲＡＭＥ）为１ ０６８ＢＰ，编码３５５个氨基酸的多肽，包含２个内含子。通过瞬时表达分析亚细胞定位，结果表明，转录因子ＧｈＷＲＫＹ４１定位于细胞核，符合转录因子特性。转基因株系发芽试验结果表明，过量表达ＧｈＷＲＫＹ４１基因，可显著提高转基因棉花在干旱、盐和低温胁迫下的发芽率；利用ＲＥＡｌ－ＴｉＭＥ ＰＣＲ技术，证明在盐和干旱胁迫条件下，转．．．

为了深入研究棉花JAZ基因在低温响应中的作用机理,利用RT-PCR方法从陆地棉中棉所36中克隆出一个低温应答基因GhJAZ1(GenBank登录号KJ562212)。全长CDS序列为810 bp,编码270个氨基酸,预测编码蛋白质的分子量为29.808 ku,理论等电点为8.33,为非跨膜蛋白。该基因编码蛋白具有一个N端NT结构域、一个TIFY结构域和一个C端Jas结构域。系统进化树分析发现,该蛋白与可可树和黄麻的亲缘关系最近。荧光实时定量PCR分析发现,GhJAZ1基因在下胚轴和根中显著高表达。此外,该

【目的】克隆陆地棉干旱胁迫谷胱甘肽还原酶基因(GhGR),并对其序列进行生物信息学分析和表达分析。【方法】利用RACE和RT-PCR技术克隆陆地棉谷胱甘肽还原酶基因的全长序列,应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过基因枪转化和实时荧光定量PCR表达对该基因表达部位和表达模式进行分析。【结果】从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)中克隆了谷胱甘肽还原酶基因GhGR,cDNA全长1 035 bp,其中,ORF为792 bp,编码263个氨基酸。氨基酸序列比对和同源性分析显示该基因与杨树(XP_002299276.1)、蓖麻(XP_002518118.1)、...

【目的】棉花是重要的纤维作物，其生长常遭受非生物逆境危害，严重影响棉花的生长和产量。Ｔｒｉｈｅｌｉｘ转录因子在植物抵御各种逆境胁迫中扮演重要作用。克隆棉花Ｔｒｉｈｅｌｉｘ转录因子基因并分析其表达特性和功能，为最终利用转基因手段改良棉花抗逆性奠定基础。【方法】通过ＢｌＡＳＴ分析比对，从棉花ｅＳＴ数据库中获得１个高度同源基因，通过基因序列分析，发现其属于Ｔｒｉｈｅｌｉｘ转录因子ＧＴ－２亚家族，命名为ＧｈＧＴ－２。以棉花叶片总ｒＮＡ为模板，根据ｅＳＴ序列设计引物，利用ｒＴ－ＰＣｒ结合ｒＡＣｅ技术，获得ＧｈＧＴ－２的编码序列。使用ＭｅＧＡ５对蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析，并构建同源物种间系统．．．

【目的】克隆陆地棉开花促进因子家族的一个基因Flowering Promoting Factor1-like Protein 5(Gh FLP5),并对其时空表达模式进行研究,解析其在开花调控过程中的作用,为创制早熟陆地棉材料奠定基础。【方法】根据NCBI数据库中的序列,用Oligo7软件设计引物,以中棉所50(CCRI50)的c DNA为模板,克隆获得Gh FLP5。在Ex PASy网站上预测其蛋白的理化性质,同时在NCBI中检索其他物种中的FPF蛋白,使用Clustal X2进行多重序列比对,并用ME

【目的】基于前期陆地棉‘新陆早19’Gossypium hirsutum‘Xinluzao 19’根部低磷胁迫基因表达谱芯片差异表达序列数据分析，挖掘相关基因，并对其克隆与表达分析。【方法】克隆陆地棉‘新陆早19’GhGDPD1基因并进行基因组DNA与cDNA测序分析，借助生物信息学方法分析GhGDPD1的基因结构和进化关系；采用半定量RT-PCR技术与实时荧光定量PCR (RT-qPCR)的方法检测该基因于根、茎、叶、花等4个组织的基因表达量的变化以及低磷胁迫下的表达模式。【结果】成功克隆GhGDPD1基因，开放阅读框序列长度为1 149 bp，共编码382个氨基酸，属于GDPD家族，其中存在一个保守结构域，名为GDPD＿GDE5＿like＿1＿plant。半定量RT-PCR和RT-qPCR试验结果均显示：GhGDPD1基因主要表达于根，中量表达于花和茎，微量表达于叶。该基因在受到低磷胁迫的刺激后，立即会对低磷胁迫做出应答，胁迫4 h相对表达量达到最高值。【结论】首次成功克隆到陆地棉‘新陆早19’GhGDPD1基因，获得了GhGDPD1基因的组织表达以及低磷胁迫下的表达模式，为深入解析棉花GhGDPD1基因的生物学功能以及培育棉花磷高效利用新种质提供科学参考。图7表1参18

【目的】本研究旨在获得叶片特异表达启动子的全长并进行表达分析,为抗逆转基因育种提供重要顺式作用元件。【方法】通过基因芯片及RT-PCR筛选鉴定出1个高活性的棉花叶片特异性表达基因,通过电子克隆及PCR获得了该基因全长,并通过染色体步移法(Genome walking)经过3次步移成功获得翻译起始位点上游2kb左右的DNA片段,将其命名为叶片特异性表达启动子LSP(leaf specific promoter)。【结果】生物信息学分析表明,该序列含有启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box及多个顺势作用元件。通过构建该启动子驱动GUS的植物表达载体p Ghlsp∷GUS,并经农杆菌花絮侵染法转化拟南芥,对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色观察,结果显示该基因主要在叶片中特异性表达,而根部以及茎部几乎不表达。【结论】LSP是一个全新的叶片特异性表达启动子,为研究外源基因在棉花叶片中的定位表达奠定基础。基因工程中利用此类启动子可以在改良棉花性状的同时减少对棉花生理方面的副作用,在棉花抗逆转基因育种方面有广泛的应用前景。