【目的】MYB基因家族作为植物中最大的转录因子家族之一，在抵御逆境胁迫中发挥着重要的作用。克隆陆地棉MYB转录因子基因GhMYB108，并进行表达分析，验证其在干旱胁迫响应中的作用，为进一步研究GhMYB108调控陆地棉耐旱的分子机制奠定基础。【方法】根据干旱转录组数据分析，确定GhMYB108为干旱响应基因；运用聚合酶链式反应（PCR）从陆地棉根系cDNA中扩增目的基因；对GhMYB108进行基因结构特征、预测基因序列信息以及系统进化关系等生物信息学分析；利用Plant Care网站对获得的基因启动子序列进行分析；在不同逆境胁迫条件下，对GhMYB108的表达特性进行qRT-PCR分析；通过亚细胞定位确定GhMYB108蛋白在细胞中的位置；利用酵母试验验证其转录活性；使用病毒诱导的基因沉默技术（virus induced gene silencing,VIGS）沉默GhMYB108，并用qRT-PCR检测基因沉默效率。观察沉默株系在干旱处理前后的表型变化，并统计存活率，采用试剂盒测定相关生理生化指标；通过对棉花叶片喷施ABA与氟啶酮试验来分析GhMYB108与ABA的关系。【结果】从陆地棉中克隆了GhMYB108(Gh＿A10G1563），其全长879 bp，编码292个氨基酸，其蛋白质相对分子量为33.288 kD，等电点为6.037，多重序列比对和保守结构域分析，发现GhMYB108含有2个高度保守的MYB结合结构域，属于典型的R2R3型MYB转录因子。不同物种亲缘关系分析发现，GhMYB108与AtMYB108、AtMYB78和AtMYB2的同源性较高，属于同一亚族，且已有研究发现AtMYB108、AtMYB78和AtMYB2与干旱或ABA信号通路相关。GhMYB108定位于细胞核，且具有转录激活活性。在干旱和对照植株中，GhMYB108均在根中表达量最高，茎中表达量最低，并且受自然干旱、18%PEG 6000模拟干旱、盐胁迫和低温等非生物胁迫诱导表达。GhMYB108沉默之后，在自然干旱条件下，沉默植株出现临界表型，与对照相比，其萎蔫更严重，且存活率降低，一些生理生化指标也发生显著变化，如叶片失水率加快，丙二醛含量升高，叶片相对含水量和脯氨酸含量减少，过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性降低，且通过DAB与NBT染色发现植物体积累了更多过氧化氢（H_2O_2）和超氧阴离子（O_2~-）。通过对棉花叶片喷施激素ABA或氟啶酮发现GhMYB108可受ABA信号的正调控。【结论】GhMYB108正调控棉花抗旱性，且受ABA信号的正调控。

【目的】从陆地棉中克隆GhNAC7,分析其结构和功能,研究其在棉花不同组织中以及叶片不同发育时期的表达量。并转入拟南芥进一步探究其在棉花叶片衰老过程中的作用。【方法】利用中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室建立的棉花衰老叶片cDNA文库中的序列,获得1个含有NAM结构域的EST,使用Oligo6.71设计引物,重新在陆地棉叶片cDNA中进行克隆。使用Gene Structure Display Server软件分析GhNAC7结构,使用在线工具Plant CARE分析启动子序列,利用在线工具G

结合ＲＡＣＥ技术与ｈｉ－ＴＡｉＬ ＰＣＲ技术克隆得到１个新的棉花ｂＺｉＰ转录因子的ＣＤＮＡ序列，暂命名为ＧｈｂＺｉＰ１。该基因包含１个完整的包含４７１ｂＰ的开放阅读框，编码１５６个氨基酸。ＧｈｂＺｉＰ１蛋白具有典型的ｂＺｉＰ保守结构域，与拟南芥等植物ｂＺｉＰ１蛋白的保守区相似性较高，推测棉花ＧｈｂＺｉＰ１与拟南芥ＡＴｂＺｉＰ１功能类似。此外，ｑＰＣＲ分析表明ＧｈｂＺｉＰ１基因在＂洞Ａ＂可育株花药的４个主要时期（小孢子单核早期、小孢子单核期、双核期及花粉形成期）的表达均明显高于不育株。由此提示，ＧｈｂＺｉＰ１基因可能与棉花雄性不育相关。

为防止棉铃脱落提高结铃性,进而提高棉花产量,从陆地棉中分离出一个参与离层分化调控的相关基因GhBOP1。通过生物信息学分析,表明GhBOP1蛋白序列含有保守性强的BTB和ANK结构域;进化树分析显示该蛋白氨基酸序列与许多植物的同源蛋白相似程度很高,说明该类蛋白进化较慢。利用qRT-PCR进行组织特异性表达分析的结果表明,GhBOP1基因在根、茎、叶和花等组织器官中均有少量表达,但在离层中为优势表达,表达量为叶片表达水平的20倍。利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术干涉棉花GhBOP1基因的表达,同时进行低盐胁迫处理分析,对照植株叶片出现大量地脱落,而GhBOP1基因沉默植株叶片生长正常。总之G...

Dirigent-like基因(DIR)编码蛋白质参与木质素的形成,与植物体的病菌防御有关。本研究以抑制差减杂交(SSH)技术获得DIR的EST为信息探针,对棉花EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了全长为768 bp的DIR基因cDNA全长,将该基因命名为GhDIR。该基因序列的开放阅读框(ORF)位于70～594 bp,推测编码175个氨基酸残基的蛋白。用陆地棉基因组DNA和cDNA分别进行了PCR扩增验证,克隆测序结果表明,所得GhDIR序列与电子克隆序列完全一致,没有内含子。序列比对和系统进化分析表明,该基因与海岛棉的同源序列表现了最高的相似性,与其他双子叶植物同源序列的相似性次之...

为研究转录因子ＧｈＷＲＫＹ４１在陆地棉盐胁迫应答过程中的作用，基于差减文库分析结果，利用ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＡＣＥ技术，克隆了ＧｈＷＲＫＹ４１基因（ＧＥｎＢＡｎＫ登录号为ｈＭ００２６３５）。该基因ＣＤｎＡ长度为１ ６３０ＢＰ，含有ＯＲＦ（ＯＰＥｎ ＲＥＡＤｉｎＧ ＦＲＡＭＥ）为１ ０６８ＢＰ，编码３５５个氨基酸的多肽，包含２个内含子。通过瞬时表达分析亚细胞定位，结果表明，转录因子ＧｈＷＲＫＹ４１定位于细胞核，符合转录因子特性。转基因株系发芽试验结果表明，过量表达ＧｈＷＲＫＹ４１基因，可显著提高转基因棉花在干旱、盐和低温胁迫下的发芽率；利用ＲＥＡｌ－ＴｉＭＥ ＰＣＲ技术，证明在盐和干旱胁迫条件下，转．．．

为了深入研究棉花JAZ基因在低温响应中的作用机理,利用RT-PCR方法从陆地棉中棉所36中克隆出一个低温应答基因GhJAZ1(GenBank登录号KJ562212)。全长CDS序列为810 bp,编码270个氨基酸,预测编码蛋白质的分子量为29.808 ku,理论等电点为8.33,为非跨膜蛋白。该基因编码蛋白具有一个N端NT结构域、一个TIFY结构域和一个C端Jas结构域。系统进化树分析发现,该蛋白与可可树和黄麻的亲缘关系最近。荧光实时定量PCR分析发现,GhJAZ1基因在下胚轴和根中显著高表达。此外,该

【目的】克隆陆地棉干旱胁迫谷胱甘肽还原酶基因(GhGR),并对其序列进行生物信息学分析和表达分析。【方法】利用RACE和RT-PCR技术克隆陆地棉谷胱甘肽还原酶基因的全长序列,应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过基因枪转化和实时荧光定量PCR表达对该基因表达部位和表达模式进行分析。【结果】从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)中克隆了谷胱甘肽还原酶基因GhGR,cDNA全长1 035 bp,其中,ORF为792 bp,编码263个氨基酸。氨基酸序列比对和同源性分析显示该基因与杨树(XP_002299276.1)、蓖麻(XP_002518118.1)、...

[目的]克隆小麦Ta WRKY28基因,通过农杆菌浸染法将其转化至拟南芥,研究转基因拟南芥植株生理生化指标变化,探究其在抵御非生物胁迫中的作用。[方法]采用RT-PCR方法,从小麦百农207 cDNA中克隆得到TaWRKY28基因,利用ProtParam等软件对其氨基酸序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法,分析TaWRKY28基因的组织表达特异性及在NaCl、ABA、H_2O_2、干旱和低温逆境胁迫下的表达情况;构建基因超表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,选取TaWRKY28基因相对表达量较高的转基因T_3拟南芥株系,测定拟南芥超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)的活性以及丙二醛(MDA)、H_2O_2和脯氨酸含量,研究TaWRKY28对拟南芥抗旱性的影响。[结果]成功克隆获得小麦TaWRKY28基因,该基因ORF全长为978 bp,编码325个氨基酸,相对分子质量为34.87 ku,理论等电点为9.27,含有1个WRKY保守结构域和1个C_2H_2锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅱ类成员。序列系统进化分析结果显示,小麦TaWRKY28与大麦HvWRKY2亲缘关系最近。亚细胞定位显示该基因位于细胞核中。qRT-PCR结果表明,TaWRKY28在小麦根、茎、叶、雌蕊和雄蕊组织中均有表达,但具有组织特异表达性,在叶中表达量最高,雄蕊中次之,雌蕊中表达量最低,且受NaCl、ABA、H_2O_2、干旱和低温胁迫后TaWRKY28表达会增强。对TaWRKY28转基因拟南芥植株的抗旱性分析表明,在干旱条件下,转基因植株的表型优于野生型,SOD、POD活性和脯氨酸含量显著增加,而H_2O_2和MDA含量显著降低,转基因植株抗旱性显著提高。[结论]克隆了小麦TaWRKY28基因,该基因可以增强转基因拟南芥植株的抗旱能力。

利用电子克隆的方法设计特异引物,克隆陆地棉的1个二硫键异构酶(Protein disulphide isomerase like)基因的全长序列。序列分析表明:该基因没有内含子,开放阅读框的长度为1 293bp,编码的多肽序列含有430个氨基酸。该基因与红麻HcPDIL5-2a基因具有97%的相似性,将该基因命名为棉花GhPDIL5-2a。取单核期花药进行半定量RT-PCR分析发现:GhPDIL5-2a在陆地棉洞A不育株和可育株花药中表达无差异,在供试的其他不同品种中的表达也无差异。

【目的】基于前期陆地棉‘新陆早19’Gossypium hirsutum‘Xinluzao 19’根部低磷胁迫基因表达谱芯片差异表达序列数据分析，挖掘相关基因，并对其克隆与表达分析。【方法】克隆陆地棉‘新陆早19’GhGDPD1基因并进行基因组DNA与cDNA测序分析，借助生物信息学方法分析GhGDPD1的基因结构和进化关系；采用半定量RT-PCR技术与实时荧光定量PCR (RT-qPCR)的方法检测该基因于根、茎、叶、花等4个组织的基因表达量的变化以及低磷胁迫下的表达模式。【结果】成功克隆GhGDPD1基因，开放阅读框序列长度为1 149 bp，共编码382个氨基酸，属于GDPD家族，其中存在一个保守结构域，名为GDPD＿GDE5＿like＿1＿plant。半定量RT-PCR和RT-qPCR试验结果均显示：GhGDPD1基因主要表达于根，中量表达于花和茎，微量表达于叶。该基因在受到低磷胁迫的刺激后，立即会对低磷胁迫做出应答，胁迫4 h相对表达量达到最高值。【结论】首次成功克隆到陆地棉‘新陆早19’GhGDPD1基因，获得了GhGDPD1基因的组织表达以及低磷胁迫下的表达模式，为深入解析棉花GhGDPD1基因的生物学功能以及培育棉花磷高效利用新种质提供科学参考。图7表1参18

【目的】研究GhUGT76C1基因调控陆地棉株高的生物学功能。【方法】以陆地棉矮化突变体LA-1为材料，克隆GhUGT76C1基因，并对克隆片段进行生物信息学及进化分析。构建过量表达载体，利用农杆菌介导法转化拟南芥获得过量表达转基因株系。通过不同光质光强处理条件下转基因株系表型鉴定分析GhUGT76C1基因在调控LA-1矮化中发挥的功能。【结果】成功克隆了陆地棉GhUGT76C1基因。GhUGT76C1基因全长1447 bp，cds序列长1365 bp，编码454个氨基酸，理论分子量为 51.31 kD，等电点为5.40，编码不稳定疏水性蛋白。GhUGT76C1蛋白的二级结构含有10个α螺旋，17个β片层区，22个转角，22个无规则卷区。系统进化树分析发现，GhUGT76C1蛋白与拟南芥同源蛋白的亲缘关系最近。成功构建陆地棉GhUGT76C1基因过量表达载体，并转化拟南芥获得过量表达转基因株系。表型分析发现，在黑暗、低光强蓝光及远红光条件下过量表达株系均出现显著的下胚轴增长的表型。【结论】首次成功克隆了陆地棉GhUGT76C1基因，并初步解析了其调控株高的功能，为深入了解陆地棉高度的调控机理提供研究材料。

为探究棉花ROP基因在非生物逆境胁迫及外源激素处理下的表达模式，利用同源克隆的方法获得2个陆地棉(Gossypium hirsutum L.)ROP基因GhROP1和GhROP8,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系，并利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对其组织表达的特异性及不同逆境胁迫和外源激素处理下的表达模式进行分析。结果表明：1)GhROP1和GhROP8基因的开放阅读框(ORF)分别为591和630 bp,各编码197和210个氨基酸，均含有1个保守的RHO结构域。2)多序列比对显示2个GhROPs蛋白均符合ROP蛋白结构特征且与其他物种ROP蛋白具有高度的相似性，聚类分析表明，GhROP1蛋白属于Ⅰ类ROP蛋白，GhROP8蛋白属于Ⅱ类。3)2个GhROPs基因在不同组织中均有表达且存在组织特异性：GhROP1基因在真叶中表达量最高，在根部和茎部表达量较低；GhROP8基因在根部表达量最高，其他组织中均为低表达量。2个GhROPs基因对于干旱、高盐、低温及高温等非生物逆境胁迫和外源脱落酸(ABA)、生长素(IAA)的处理均有响应：2个GhROPs基因表达均受干旱胁迫诱导；GhROP1基因表达受高盐胁迫抑制，而GhROP8基因受高盐胁迫诱导；低温处理下2个GhROPs基因表达均呈先下调后上调趋势；高温处理下GhROP1基因表达均呈先下调后上调趋势，GhROP8基因表达呈先上调后下调再上调趋势；2个GhROPs基因表达均受外源ABA抑制；外源IAA处理下GhROP1基因呈先上调后下调再上调趋势，GhROP8基因表达受外源IAA诱导。综上，GhROP1和GhROP8是参与棉花响应多种逆境胁迫的重要基因。

[目的]本文旨在克隆陆地棉U-box E3泛素连接酶基因GhPUB19D并分析其在抵御生物和非生物胁迫中的功能及其作用机制。[方法]利用PCR从棉花cDNA文库中扩增盐胁迫和大丽轮枝菌处理均上调表达的GhPUB19D全长cDNA;qRT-PCR分析GhPUB19D的组织表达特征及其对不同非生物胁迫处理的响应;构建pBIN-GhPUB19D-GFP载体并导入烟草叶片中,分析GhPUB19D的亚细胞定位;利用病毒介导的基因沉默(VIGS)和转基因过表达GhPUB19D基因分析该基因对植物的耐盐性和抗病性的影响。[结果]GhPUB19D基因ORF全长2 043 bp,编码680个氨基酸,其编码的蛋白质含有1个U-Box和3个ARM结构域,定位于高尔基体。GhPUB19D基因启动子区存在多种逆境胁迫响应顺式作用元件。GhPUB19D在棉花根和叶片中优势表达。聚乙二醇(PEG)、NaCl、脱落酸(ABA)、乙烯(ET)、水杨酸(SA)、赤霉素(GA3)处理后,均可诱导GhPUB19D在1 h达到表达峰值。VIGS沉默GhPUB19D棉花在接种大丽轮枝菌Vd991之后,叶片黄化和枯萎较正常植物更为严重,植株发病率和病情指数均极显著增加。转GhPUB19D基因可以提高拟南芥在ABA处理下的种子萌发率,但不能减轻ABA对幼苗生长的抑制作用;转GhPUB19D基因可以提高拟南芥幼苗的耐盐性,ABA的SnRK2.3/2.6信号通路下游的AtABF3和AtABF4对盐胁迫的响应增强,而AtRD26、AtMYB44、AtRAB18、SLAH3等对盐胁迫的响应减弱。转GhPUB19D基因可以显著减轻大丽轮枝菌病症,显著降低拟南芥植株中大丽轮枝菌含量,提高AtPR1、AtPR2、AtPR3、AtPR4、AtPR5、AtNPR1等系统获得抗性相关基因的表达及其对大丽轮枝菌的响应。[结论]过量表达GhPUB19D可显著提高植物的耐盐性和黄萎病抗性。

【目的】对陆地棉trihelix转录因子基因在多种胁迫下的应答表达模式进行研究分析,为棉花抗逆相关基因克隆及阐明棉花抗逆分子机制奠定基础。【方法】根据已知24个trihelix转录因子EST序列设计引物,通过RT-PCR和qRT-PCR的方法分析棉花(Gossypium hirsutum L.)GhGT在高盐(200 mmol.L-1NaCl)、干旱、低温(4℃)等非生物胁迫和外源激素ABA(100μmol.L-1)处理下的表达模式。【结果】12个基因响应高盐和干旱胁迫应答,7个基因响应冷胁迫应答,应答ABA处理的基因9个。此外,有3个基因(GhGT2、GhGT18和GhGT23)在4种处理下...