【目的】扩展蛋白(Expansin)是细胞壁的重要组成部分,在植物的生长发育及逆境胁迫应答等方面均发挥着重要作用。基于全基因组水平系统鉴定陆地棉Expansin基因家族,并通过生物信息学及表达模式分析,为揭示扩展蛋白基因在棉花生长发育中的功能及后续利用奠定基础。【方法】利用BLAST和HMMER在陆地棉基因组中搜索并鉴定扩展蛋白基因家族成员;利用ClustalW、MEGA、MCScanX、Prot Param、MEME、SignalP、Euk-mPLoc、FancyGene和DnaSP等软件对其基因序列和蛋白序列进行生物信息学分析。通过RNA-seq数据分析扩展蛋白基因的表达模式和部分同源基因间表达差异,利用qRT-PCR验证部分扩展蛋白基因的表达谱。【结果】陆地棉基因组中含有46个EXPA基因、8个EXPB基因、6个EXLA基因和12个EXLB基因,合计72个Expansin基因;四倍体陆地棉中扩展蛋白成员的数量几乎是二倍体棉种(亚洲棉与雷蒙德氏棉)的2倍。除GhA02和GhD06 2个染色体外,其余各染色体上均分布有数目不等的扩展蛋白基因(2—4个),具有部分同源关系的染色体GhA08和GhD08分别有5个和8个扩展蛋白基因。系统发育树显示,各亚家族成员聚集成群,并且大部分的末端分支均由来源于3个物种的4个(亚)基因组的4个基因组成,如EXPA亚家族的Cotton_A_28454/Gh_A03G0885/Gh_D02G1269/Gorai.005G142200等等,4个基因之间具有同线性关系。亚细胞定位发现陆地棉所有的扩展蛋白均位于细胞外。基因结构分析显示,扩展蛋白基因由3—5个外显子组成,外显子-内含子结构在进化上高度保守且与氨基酸序列的多样性一致,且在外显子上存在密码子偏好性。RNA-seq数据显示,不同基因在不同时空条件下存在特异性表达,如GhEXPA19A和GhEXPA19D相比其他基因在纤维10 DPA和20 DPA中的表达量很高;在不同的组织(如子叶、新叶、老叶、苞叶)中,GhEXPA24D具有较高的表达量。部分同源基因之间具有不同的表达模式,显示它们之间功能的异化与互补。qRT-PCR结果与RNA-seq数据基本吻合,如GhEXLA3A和GhEXLA3D在纤维发育的伸长阶段高量表达。GhEXPA19D和GhEXLA2D在3DPA的胚珠中表达活跃。【结论】陆地棉基因组中含72个扩展蛋白基因,其在DNA水平和氨基酸水平具有一致的结构多样性和进化保守性,在转录水平具有各异的表达模式,显示出家族内成员间功能上的异化与互补。

扩展蛋白具有松驰细胞壁和增加细胞壁柔韧性的功能。为了弄清该基因家族在雷蒙德氏棉中的特征，利用隐马尔科夫模型（ＨＭＭ）在雷蒙德氏棉基因组中进行扩展蛋白家族基因成员的鉴定，获得了３９个扩展蛋白基因家族成员，分布在１２条染色体上。系统发育分析将其归入ＥＸＰＡ、ＥＸＰＢ、ＥＸＬＡ和ＥＸＬＢ共４个亚家族，分别含有２６，４，３，６个基因。各亚家族中扩展蛋白基因具有相对多样化的基因结构；扩展蛋白基因家族在进化中经历了３次扩张；染色体片段重复是该基因家族扩张的主要方式；扩张后纯化选择占主导地位。比较棉纤维发育不同时期及叶片、花瓣的深度测序和基因芯片表达谱，发现大部分扩展蛋白基因参与了雷蒙德氏棉纤维、叶片和花瓣．．．

为探究棉花ROP基因在非生物逆境胁迫及外源激素处理下的表达模式，利用同源克隆的方法获得2个陆地棉(Gossypium hirsutum L.)ROP基因GhROP1和GhROP8,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系，并利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对其组织表达的特异性及不同逆境胁迫和外源激素处理下的表达模式进行分析。结果表明：1)GhROP1和GhROP8基因的开放阅读框(ORF)分别为591和630 bp,各编码197和210个氨基酸，均含有1个保守的RHO结构域。2)多序列比对显示2个GhROPs蛋白均符合ROP蛋白结构特征且与其他物种ROP蛋白具有高度的相似性，聚类分析表明，GhROP1蛋白属于Ⅰ类ROP蛋白，GhROP8蛋白属于Ⅱ类。3)2个GhROPs基因在不同组织中均有表达且存在组织特异性：GhROP1基因在真叶中表达量最高，在根部和茎部表达量较低；GhROP8基因在根部表达量最高，其他组织中均为低表达量。2个GhROPs基因对于干旱、高盐、低温及高温等非生物逆境胁迫和外源脱落酸(ABA)、生长素(IAA)的处理均有响应：2个GhROPs基因表达均受干旱胁迫诱导；GhROP1基因表达受高盐胁迫抑制，而GhROP8基因受高盐胁迫诱导；低温处理下2个GhROPs基因表达均呈先下调后上调趋势；高温处理下GhROP1基因表达均呈先下调后上调趋势，GhROP8基因表达呈先上调后下调再上调趋势；2个GhROPs基因表达均受外源ABA抑制；外源IAA处理下GhROP1基因呈先上调后下调再上调趋势，GhROP8基因表达受外源IAA诱导。综上，GhROP1和GhROP8是参与棉花响应多种逆境胁迫的重要基因。

目的发掘陆地棉Dirigent-like蛋白基因家族,明确不同黄萎病抗性品种间该基因家族成员的多态性及表达差异。方法利用Illumina Hiseq 2000测序平台,通过RNA-Seq测序技术,获得黄萎病菌侵染陆地棉抗病品种和感病品种的Dirigent-like蛋白基因家族成员Unigene序列;采用生物信息学软件对其进行核苷酸序列及编码蛋白的多重比对和系统进化分析;针对该家族成员设计特异的quantitative real-time PCR引物,在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System上使用SYBR green PCR试剂盒标记反应产物,棉...

【目的】克隆陆地棉干旱胁迫谷胱甘肽还原酶基因(GhGR),并对其序列进行生物信息学分析和表达分析。【方法】利用RACE和RT-PCR技术克隆陆地棉谷胱甘肽还原酶基因的全长序列,应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过基因枪转化和实时荧光定量PCR表达对该基因表达部位和表达模式进行分析。【结果】从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)中克隆了谷胱甘肽还原酶基因GhGR,cDNA全长1 035 bp,其中,ORF为792 bp,编码263个氨基酸。氨基酸序列比对和同源性分析显示该基因与杨树(XP_002299276.1)、蓖麻(XP_002518118.1)、...

【目的】富含半胱氨酸类受体激酶(CRK)是植物中最大的类受体激酶家族之一,在植物生长发育、激素信号传导和抗逆境胁迫中发挥重要作用。从全基因组水平鉴定陆地棉CRK基因家族并进行生物信息学和表达模式分析,为研究和利用陆地棉CRK基因家族奠定基础。【方法】从Pfam数据库下载stress-antifung结构域氨基酸序列,应用BLASTp程序搜索棉花基因组数据库,鉴定棉花CRK基因家族;利用Compute p I/Mw tool、Signal P、TMHMM Server V2.0、Wo LF POSRT等在线工具预测陆地棉CRK家族蛋白的分子量、信号肽、跨膜结构域和亚细胞定位等;用Clustal X1.8软件对棉花和拟南芥CRK蛋白质进行氨基酸序列比对,MEGA5.0分析棉花和拟南芥CRK蛋白的系统进化关系;使用TBtools制作陆地棉CRK基因家族的染色体定位、基因结构和蛋白质结构域示意图;应用植物顺式调控元件数据库Plant CARE分析棉花启动子序列;通过植物磷酸化位点数据库Plant Phos预测陆地棉CRK家族蛋白的磷酸化位点;从NCBI数据库下载RNA-Seq数据,利用转录组定量工具Kallisto计算TPM值,通过在线工具Morpheus绘制陆地棉CRK家族基因表达热图。【结果】陆地棉基因组中有70个CRK基因,分布于14条染色体,其中52个基因(74.3%)集中串联成簇分布于A6/D6、A9/D9、A10/D10染色体,且在A/D染色体组之间呈现高度共线性关系。编码302—901个氨基酸,58个蛋白质(82.9%)具有跨膜结构域,主要定位于叶绿体、质膜和胞外。磷酸化位点预测结果表明,陆地棉和拟南芥CRK有5个相同的磷酸化位点基序,包括3种丝氨酸磷酸化位点基序和2种苏氨酸磷酸化位点基序。65个陆地棉CRK基因的启动子区(92.9%)至少含有一种逆境激素响应元件,69个基因启动子区(98.6%)至少含有一种生物或非生物胁迫响应元件。根据RNA-Seq数据分析结果,陆地棉CRK基因可分为3种不同的组织表达特征类型;盐、干旱、冷、热胁迫以及接种大丽轮枝菌均可以导致部分陆地棉CRK基因表达水平的改变。Gh CRK25在根、茎、叶和胚珠中优势表达,在纤维中几乎不表达,ABA、GA3、SA、PEG-6000、氯化钠和大丽轮枝菌Vd991处理均能刺激Gh CRK25迅速上调表达。应用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)沉默Gh CRK25可导致棉花对大丽轮枝菌Vd991更为敏感。【结论】陆地棉CRK基因家族有70个成员,具有保守的基因结构和功能结构域,多样化的组织表达特征,大多数基因受激素和逆境调控。

当前在ＮＣＢＩ中提交的来源于陆地棉的ＥＰＳＰＳ基因有２个，随着陆地棉基因组测序结果的公布，为在陆地棉基因组中全面鉴定ＥＰＳＰＳ基因的存在提供了便利条件。从陆地棉异源四倍体标准系ＴＭ－１基因组数据库中共搜寻获得４个ＥＰＳＰＳ同源基因，这４个基因分别分布在Ａ０７、Ａ１２、Ｄ０７和Ｄ１２亚基因组。从这４个基因的核苷酸序列、氨基酸序列和基因结构的比对，构建进化树的系统发育分析以及基因的转录情况研究来看，定位在Ａ０７和Ｄ０７亚基因组的２个基因属于共线性高度同源基因，定位在Ａ１２和Ｄ１２亚基因组的２个基因也是相同的情况。序列比对结果表明，已经在ＮＣＢＩ中提交的２个ＥＰＳＰＳ基因分别是定位在Ａ１２和Ｄ１２亚．．．

ＺＩＰ基因家族是生物体内非常重要的一类金属阳离子转运蛋白基因家族，通过对陆地棉基因组的全面分析和鉴定，获得ＧｈＺＩＰ基因家族系统性的生物学信息。运用比较基因组学的方法，从陆地棉异源四倍体标准系ＴＭ－１基因组数据库中鉴定出４５个ＧｈＺＩＰ基因，这些基因分布在除了Ａ０４、Ａ０９、Ｄ０４和Ｄ０９号亚基因组以外的２２个亚基因组，Ｄ亚组比Ａ亚组多５个ＧｈＺＩＰ基因，有１６对基因在Ａ亚组和相对的Ｄ亚组上存在一一对应关系。有４４个ＧｈＺＩＰ基因具有跨膜结构，其中有３６个ＧｈＺＩＰ基因的跨膜结构域是６～９个，具有ｈＩｓ富集区序列并位于膜内侧可变区的有２０个ＧｈＺＩＰ基因，只有１个ＧｈＺＩＰ基因亚细胞定位不在细．．．

Dirigent-like基因(DIR)编码蛋白质参与木质素的形成,与植物体的病菌防御有关。本研究以抑制差减杂交(SSH)技术获得DIR的EST为信息探针,对棉花EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了全长为768 bp的DIR基因cDNA全长,将该基因命名为GhDIR。该基因序列的开放阅读框(ORF)位于70～594 bp,推测编码175个氨基酸残基的蛋白。用陆地棉基因组DNA和cDNA分别进行了PCR扩增验证,克隆测序结果表明,所得GhDIR序列与电子克隆序列完全一致,没有内含子。序列比对和系统进化分析表明,该基因与海岛棉的同源序列表现了最高的相似性,与其他双子叶植物同源序列的相似性次之...

应用SSH-PCR技术,在筛选到抗旱相关基因的EST序列基础上,采用RACE技术,分离克隆到全长为801bp,含编码序列(CDS)为522 bp的棉花抗旱相关基因GhCYP1。氨基酸序列比对发现,该基因与拟南芥、水稻、人等的亲环蛋白基因高度同源,都具有由11个连续氨基酸所组成的单结构域亲环蛋白典型结构,且在保守区都具有PPIase活性所必需的3个氨基酸(R、F、H)以及与环孢素A(CsA)结合位点密切相关的色氨酸(W)。利用半定量RT-PCR对该基因的表达模式进行分析,发现其在棉花的叶、茎、根中均有表达,且在根中的表达量最高,暗示了该基因可能与植物根系吸水及矿物运输有关,从而在棉花适应干旱胁迫...

为了分析马铃薯扩展蛋白基因家族的进化与功能,鉴定了马铃薯的扩展蛋白基因家族,分析了其基因结构特征、系统发育及表达模式等。结果表明,马铃薯基因组包含33个扩展蛋白基因,包括A(21)、B(5)、LA(1)和LB(6)4个亚家族,分布在马铃薯11条染色体上。扩展蛋白氨基酸长度为194488 aa,编码蛋白质具有保守的结构域,蛋白质亚细胞定位预测结果表明所有蛋白均定位于细胞外。基因结构分析表明,马铃薯扩展蛋白家族有23个基因(69.7%)含有23个内含子。基因表达分析发现,该家族基因在马铃薯根、茎、匍匐茎、果实

利用电子克隆的方法设计特异引物,克隆陆地棉的1个二硫键异构酶(Protein disulphide isomerase like)基因的全长序列。序列分析表明:该基因没有内含子,开放阅读框的长度为1 293bp,编码的多肽序列含有430个氨基酸。该基因与红麻HcPDIL5-2a基因具有97%的相似性,将该基因命名为棉花GhPDIL5-2a。取单核期花药进行半定量RT-PCR分析发现:GhPDIL5-2a在陆地棉洞A不育株和可育株花药中表达无差异,在供试的其他不同品种中的表达也无差异。

BES1基因是植物激素油菜素内酯信号转导过程中的重要转录因子,为了解陆地棉油菜素内酯信号基因Gh BESI家族,通过对陆地棉异源四倍体标准系TM-1基因组数据库的全面分析和鉴定,获得21个GhBES1基因,这些基因分布在不同的亚基因组,有9对基因在A亚组和D亚组上存在对应关系,AD亚组对应基因序列一致性高于95%。根据进化分析,21个GhBES1基因分为4个亚家族,除了亚家族Ⅲ,其他3个亚家族在拟南芥中均有对应基因;除了亚家族Ⅳ基因和亚家族Ⅱ中GhBES1-1基因外,其他GhBES1基因均有2个外显子。亚

鉴定陆地棉SKS基因家族成员，解析其演化规律，为棉花抗性育种提供新的候选基因。基于已公布的陆地棉遗传标准系TM-1基因组数据，以陆地棉品种中棉-14为试验材料。通过生物信息学对陆地棉SKS家族成员进行全基因组鉴定，并对其家族成员的染色体分布、进化关系、基因结构、共线性关系等进行预测分析。通过实时荧光定量聚合酶链式反应分析GhSKS13的表达模式，并利用病毒诱导的基因沉默技术初步探究陆地棉SKS13在棉花抵御大丽轮枝菌过程中的功能。共鉴定到48个陆地棉SKS基因，不均匀分布于陆地棉19条染色体上，聚类分析分为5个亚组，基因序列具有较高保守性，共线性关系分析显示，陆地棉SKS基因家族受到纯化选择。组织模式表达分析显示，GhSKS13在陆地棉根组织中优势表达，并且受大丽轮枝菌诱导显著上调表达。GhSKS13沉默植株对大丽轮枝菌抗性减弱，同时抑制病程相关基因GhPR1、GhPR2、GhPR3和GhPR5表达。大丽轮枝菌入侵GhSKS13沉默植株，其过氧化氢(H_2O_2)沉积明显低于对照，暗示GhSKS13促进活性氧(ROS)的形成。总之，明确了陆地棉SKS家族成员的系统进化关系、染色体分布特征和基因结构特征；并阐明了GhSKS13参与棉花对大丽轮枝菌抗性反应。

为了进一步了解ＮＦ－ＹＢ基因家族结构的功能，利用生物信息学手段，系统研究了陆地棉标准系ＴＭ－１基因组中ＮＦ－ＹＢ基因家族的数目、亚细胞定位、染色体分布、进化关系、基序以及组织表达情况。结果表明：ＴＭ－１基因组中共有４１个ＮＦ－ＹＢ基因家族成员，它们含有相同的ＣＢＦＤ＿ＮＦＹＢ＿ＨＭＦ结构域，大部分定位到细胞核内；４１个ＮＦ－ＹＢ基因家族成员分布在１９条染色体上，其中有１９组成员在Ａ亚组和Ｄ亚组中表现为直系同源基因；进化树分为Ⅰ和Ⅱ２个小组，每个小组成员间具有相似的基序类型和排列顺序；组织表达分析则发现，在这４１个ＮＦ－ＹＢ基因家族成员中，至少有２４个成员可以进行表达，且表现出一定的组织特异性。