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[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘光远 田占成 才学鹏 李知新 谢俊仁 王路 张林 龚真莉
【目的】以长角血蜱卵为材料构建高质量的长角血蜱卵cDNA表达文库,为进一步筛选克隆目的基因奠定基础。【方法】在无RNA酶污染的环境下从长角血蜱卵中提取RNA,进而纯化mRNA,采取oligo(dT)引物合成双链cDNA,定向克隆到λSCREEN载体。用PhageMaker extract对其进行体外包装以形成完整的噬菌体,转染大肠杆菌ER1647,测定库容量。并用构建的cDNA文库克隆已知的长角血蜱促卵泡激素基因。【结果】所构建长角血蜱卵cDNA表达文库的基础库容量约为1.38×106PFU,重组率为100%,扩增后文库的滴度为2×109PFU·ml-1。获得了目的基因,其序列与GenBank...
关键词：
长角血蜱 卵 cDNA表达文库 构建
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李梦辉 刘连瑞 涂浩 黄经纬 张振超 徐立新 严若峰 李祥瑞 宋小凯
[目的]为了寻找可用于研制高效重组疫苗的抗原基因,利用gateway技术构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA表达文库。[方法]首先从新鲜分离的巨型艾美耳球虫孢子化卵囊中提取总RNA并分离纯化mRNA,用Clone MinerTMⅡcDNA文库构建试剂盒构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA初级文库,然后将cDNA从初级文库重组到p VAX1.0上,构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA表达文库,最后用7个已知巨型艾美耳球虫基因的引物鉴定文库。[结果]构建的巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA初级文库总容量为0.92×107CFU,插入片段平均大小为1.63 kb;表达文库总容量为2.32×107CFU...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李梦辉 刘连瑞 涂浩 黄经纬 张振超 徐立新 严若峰 李祥瑞 宋小凯
［目的］为了寻找可用于研制高效重组疫苗的抗原基因，利用ｇａｔｅｗａｙ技术构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊ｃＤＮａ表达文库。［方法］首先从新鲜分离的巨型艾美耳球虫孢子化卵囊中提取总ＲＮａ并分离纯化ｍＲＮａ，用ｃｌｏＮｅ ｍｉＮｅＲｔｍⅡｃＤＮａ文库构建试剂盒构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊ｃＤＮａ初级文库，然后将ｃＤＮａ从初级文库重组到ｐ ＶａＸ１．０上，构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊ｃＤＮａ表达文库，最后用７个已知巨型艾美耳球虫基因的引物鉴定文库。［结果］构建的巨型艾美耳球虫孢子化卵囊ｃＤＮａ初级文库总容量为０．９２×１０７ｃＦＵ，插入片段平均大小为１．６３ ｋｂ；表达文库总容量为２．３２×１０７ｃＦＵ．．．
[期刊] 林业科学研究
[作者]
刘明英 乔桂荣 蒋晶 邱文敏 卓仁英
以筛选出的镉超积累矿山型东南景天为材料,经镉胁迫后提取总RNA,纯化mRNA,利用改良SMART技术合成了全长cDNA,回收500 bp以上cDNA大片段克隆到改造过的大肠杆菌/酵母穿梭载体pYES2.0G中,建成东南景天镉全长cDNA文库,对随机挑取的阳性克隆进行PCR鉴定,插入片断大小在1 000 bp左右,说明所构建的文库达到了用于目的基因分离筛选和表达的建库要求,为将来筛选克隆与东南景天抗重金属相关基因奠定了基础。
关键词：
东南景天 cDNA文库 耐镉 酿酒酵母
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李有全 罗建勋 高金亮 关贵全 马米玲 刘志杰 刘军龙 刘爱红 任巧云 党志胜 鲁炳义 刘光远 白启 殷宏
【目的】构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,并从中筛选抗原候选基因。【方法】从吕氏泰勒虫裂殖子直接提取和纯化mRNA,采用oligo(dT)引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将所产生的cDNA分子定向克隆到具有EcoRⅠ/HindⅢ粘性末端的λSCREEN载体的两臂之间。用PhageMaker extract对连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,并用之转染大肠杆菌ER1647,从而构建成吕氏泰勒虫的cDNA表达文库。用吕氏泰勒虫阳性血清和兔抗绵羊IgG-AP筛选得到阳性克隆,经测序和Blast软件分析并获得新基因。【结果】成功构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
杨丽鸳 朱梦奕 何璟
为了探讨硫藤黄链霉菌中可能存在的次级代谢产物合成及调控机制，以链霉菌整合型质粒ｐＪＴＵ２５５４为载体，构建了硫藤黄链霉菌的基因组表达文库。以模式菌株变铅青链霉菌为异源表达宿主，通过生物活性筛选获得９株具有抑菌活性的异源表达突变菌株，同时通过ｐＣＲ筛选获得多个含有聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因的克隆子。ＴＬＣ及ＨｐＬＣ－ＭＳ分析发现６个携带有ａＵＲｅｏＴＨｉｎ生物合成基因簇的ＣｏＳＭｉｄ，通过异源表达在变铅青链霉菌中成功合成聚酮类抗生素ａＵＲｅｏＴＨｉｎ，证实文库异源表达及筛选的有效性。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李雯 郭巍 张霞
昆虫围食膜是由几丁质和蛋白质组成一个半透膜结构,由中肠分泌,保护细胞免受机械性损伤和细胞微生物感染。以害虫生物防治的新靶标——中肠围食膜作为研究对象,分离和鉴定甜菜夜蛾中肠围食膜蛋白基因。依据免疫学筛选方法,用制备的甜菜夜蛾围食膜蛋白多克隆抗体,对甜菜夜蛾中肠cDNA表达文库进行免疫筛选。获得231个围食膜蛋白阳性克隆,经测序、生物信息学分析可知得到8个几丁质结合蛋白,2个肠粘蛋白;并对结构功能进行分析预测。研究结果为揭示围食膜分子结构,进一步以中肠围食膜为靶标进行生物防治奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李杰 张霞 郭巍 刘小民 李新娜 赵丹
昆虫围食膜是保护其中肠的一道物理屏障,破坏围食膜就可能使其中肠处于不正常的生理状态而最终导致死亡。本研究提取棉铃虫Helicoverpa armigera(Hbner)围食膜蛋白,成功制备棉铃虫围食膜蛋白多克隆抗体,并对棉铃虫中肠cDNA表达文库进行免疫筛选,共得到385个阳性克隆。对其中26个克隆进行鉴定并测序分析,结果表明19个克隆为肠粘蛋白。过碘酸-希夫试剂(PAS)显色法检测棉铃虫围食膜蛋白组成,发现围食膜蛋白大部分为糖蛋白。通过对棉铃虫中肠围食膜蛋白的分离鉴定,为进一步分析棉铃虫围食膜蛋白的生理功能,寻找生物防治新靶标,开发新型高效生物杀虫剂提供理论依据。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘培 俞燕飞 陶美凤
灰红链霉菌AL7对多种植物病原真菌和细菌都具有明显的抑菌活性。本研究在通用的大肠杆菌克隆宿主基础上,构建获得Dcm甲基化缺陷菌株,再引入接合转移辅助质粒pUZ8002得到菌株LP3。以LP3为宿主构建灰红链霉菌AL7的基因组粘粒文库,平均插入片段大小40kb。用高通量接合转移的方法将文库转到变铅青链霉菌TK24中,得到了异源表达文库,并从表达文库中初筛获得一些表型特异的克隆,如光秃表型、产素提前表型、产孢提前表型等。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
陈金平 王斌 吴文化 梁冰 张树义
应用抑制差减杂交(SSH)技术构建了施氏鲟(Acipenser schrenckii)精巢和卵巢组织的SMART cDNA文库及其cD-NA差减文库,从两个差减文库中随机挑取200个克隆进行PCR检测,随机挑选其中的123个cDNA克隆测序。将所测序列经GenBank检索和生物信息学比较,发现有55个cDNA片段序列在GenBank上无明显的同源性,68个片段与已报道的基因有较高的同源性,其中17个cDNA片断为精巢中特异表达的基因,而51个为卵巢中特异表达的基因。精巢中大量表达的主要为延长因子(EF-1)和脂肪酸连接蛋白等与精子生成发育有关的基因,而卵巢主要为ZPC、组蛋白和周期蛋白等与卵细...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
郭俣 刘长青 陆涛峰 佟春玲 修晓娜 关伟军 马月辉
利用SMART技术构建了北京油鸡肝脏全长cDNA文库,构建的未扩增文库滴度为1.96×106pfu·mL-1,文库重组率为92.8%,插入片段长度为1.23kb,扩增文库滴度为1.64×1010pfu·mL-1。设计purH基因保守引物对该文库进行筛选,克隆了北京油鸡purH基因(GenBank登录号:EU334506),将purH基因完整开放阅读框定向插入pEGFP-N3,构建带有GFP报告基因重组表达载体pEGFP-N3-purH,将其导入北京油鸡体外培养细胞中。转染后24、48和72h,pEGFP-N3-purH转染率为10.3%～53.2%,绿色荧光均匀分布于细胞质与细胞核中。随表达量...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
黎铭 陈晓汉 熊建华 李咏梅 陈秀荔 蒋伟明 曾地刚 彭敏 马宁 杨春玲
为了寻找对虾抗桃拉病毒(TSV)相关基因信息,研究对虾抗TSV分子机理。应用抑制性差减杂交(SSH)技术,构建TSV感染后存活凡纳宾对虾与未感染凡纳宾对虾的基因差异表达文库,并通过相对定量PCR以及斑点杂交分别对SSH的效率以及文库的可靠性进行验证。结果表明,SPR凡纳宾对虾和SPF凡纳宾对虾攻毒后的死亡率分别为12%和90%;在SSH系统中,相对于未进行杂交的cDNA样品,杂交后的cDNA样品的β-肌动蛋白(β-actin)几乎没有被检测出,说明SSH操作系统是高效率的。通过文库构建则获得正负2个文库,其中正库含阳性克隆1051个,负库含阳性克隆580个;而经斑点杂交验证,共获差异表达克隆3...
[期刊] 林业科学
[作者]
黄麟 徐旭凌 李超 叶建仁 吴小芹
松材线虫取食和致病相关基因的鉴定是揭示松材线虫病致病机制的重要研究内容。以松材线虫混合虫体为测试方,线虫卵为驱动方,构建二者差减cDNA文库。文库测序结果经序列拼接、功能注释,共获得松材线虫虫体特异表达的有效EST序列354个,拼接后获得34个重叠群,其中15个重叠群获得明确的功能注释,其中MixC12、MixC25、MixC33分别与过氧化物酶、β-1,4内切葡聚糖酶、锌指家族蛋白有较高的同源性,这些基因被认为与植物线虫的取食和致病性密切相关。RT-PCR分析验证了所获得的差减cDNA的代表性。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
赵明文 李娜 梁婉琪 王南 张大兵 潘迎捷
根据对韩国灵芝菌丝体、不同发育阶段子实体及孢子粉中灵芝酸含量的测定结果 ,以含量较高的灵芝原基为材料 ,提取mRNA ,从而构建以λZAPExpress为载体的表达型cDNA文库。经检测 ,所构建文库的滴度达到 6× 10 5pfu·mL-1,重组率达到 96 % ,插入片段的大小均在 70 0bp以上。该表达文库的构建 ,为进一步克隆和鉴定灵芝酸合成的相关基因打下了良好的基础。
关键词：
灵芝酸 原基 cDNA表达文库
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
陈华 蔡铁城 张冲 邓烨 熊发前 唐荣华 周双彪 庄伟建
以‘闽花6号’品种为材料,利用SMART技术成功构建了花生叶不同生育时期混合的全长c DNA文库,并对文库的部分序列进行测序及分析.结果表明,该文库原始库容为2.25×106cfu·m L-1,重组率达100%,插入片段大小为750-2000bp,平均插入片段大小为1000 bp,达到文库质量要求.随机挑选50个单克隆进行5'端测序,共获得50条有效序列.通过与NCBI非冗余蛋白质数据库进行比对和注释,获得已知功能基因或具推测功能的基因25个,未知功能基因14个,新基因11个,其中49个(98%)基因为花生未报道的基因.参与代谢过程和胁迫响应的基因表达量较高.
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