对长沙地区160份南瓜疑似病毒病样品进行小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)检测,检出率达46.9%。为进一步明确长沙地区ZYMV分离物的分类地位和分子进化特征,克隆获得了1个长沙地区ZYMV外壳蛋白基因,与Gen Bank已报道的ZYMV外壳蛋白基因比对,并进行基因重组、系统发生、遗传差异、选择压力、种群结构和基因漂流分析。结果显示:长沙地区ZYMV外壳蛋白基因没有发生明显的重组,突变与负选择作用是其进化的主要驱动力,种群结构相对稳定,但正处于扩张的趋

从辽宁省沈阳市和盖州市分别采集表现花叶的南瓜样品,经透射电镜负染色实验,观察到典型的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)线状病毒粒子.利用Potyvirus通用引物Legpoty F/LegpotyR分别对3个沈阳样品和3个盖州样品进行RT-PCR扩增,得到预期片段,克隆并测序.Blast显示6个病毒样本与小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)同源性最高,均大于99%.利用已经报道的特异引物ZYMV-F/ZYMV-R,从6个样本中扩增到约1.2 kb的ZYMV片段,片段包含完整的外壳蛋白(CP)基因.基于CP的核

【目的】小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)是危害西瓜最为普遍的病毒,在西瓜上利用外源喷施病毒基因dsRNA的方法实现对ZYMV的预防和治疗。【方法】首先以实验室已有的ZYMV病毒序列为依据,针对其不同的基因片段,利用NCBI数据库找出与其相似的序列。随后利用软件DNAMAN8对序列进行多重比对分析,找出其保守区域,根据分析结果选择长度介于200—350 bp的ZYMV 3′UTR、6K2、HC-Pro、P3、NIb 5个基因片段,同时选择长度为190 bp的GUS基因片段作为对照。PCR扩增得到这6个片段后,利用同源重组的方法将它们插入到含有双T7启动子的L4440载体中,并利用RNAⅢ酶缺陷型大肠杆菌HT115建立原核表达系统生产dsRNA,采用超声波破碎的方法释放dsRNA,利用TE(10 mmol·L~(-1) Tris-HCl和1 mmol·L~(-1) EDTA)缓冲液溶解dsRNA,最后比较和分析IPTG使用浓度、诱导时间以及超声波破碎时间对dsRNA表达和释放的影响。在西瓜植株上采用喷施的方法施用dsRNA,设计先喷施dsRNA后接种病毒的预防试验和先接种病毒后喷施dsRNA的治疗试验,通过统计分析接种病毒后21 d发病率的方法评价dsRNA预防和治疗ZYMV的效果。【结果】针对ZYMV的3′UTR、6K2、HC-Pro、P3、NIb 5个基因片段以及GUS基因片段建立了能够高效稳定表达和释放dsRNA的生产体系。在IPTG诱导浓度为8 mmol·L~(-1),诱导时间为7 h,在宁波新芝牌超声波细胞破碎仪3?的档位和60%的输出功率条件下破碎15 min,细胞可以有效产生和释放dsRNA。在对ZYMV的预防试验中发现,喷施GUS基因片段的dsRNA以及TE缓冲液的西瓜植株发病率均为100%的情况下,对ZYMV防治效果最好的是HC-Pro基因片段,接种ZYMV 21 d后防治效果可达到95%,防治效果相对较差的是NIb基因片段,但也可达到80%。在此基础上对HC-Pro片段预防和治疗ZYMV的效果进行了深入分析,结果发现在喷施HC-Pro片段的dsRNA后第3、5、7天接种ZYMV,植株发病率分别为16%、63%、63%,在接种ZYMV后第1、3、5、7天分别喷施HC-Pro片段的dsRNA,无明显的治疗效果,仅起到延迟植株发病的效果。【结论】建立了针对ZYMV不同基因片段的dsRNA原核表达体系,并发现基于HC-Pro基因片段产生的dsRNA对ZYMV防治效果最好,可显著降低植株的发病率、延迟植株发病时间,具有应用潜力。

为了检测和鉴定山东地区葫芦科蔬菜上病毒病种类，从山东诸地１１个蔬菜种植区采集了８６７个葫芦科蔬菜疑似感病样品。利用黄瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、西瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、南瓜花叶病毒、甜瓜黄斑病毒、瓜类褪绿黄化病毒、李属坏死环斑病毒及甜瓜坏死斑点病毒等特异性引物对疑似感病样品分别进行ＲＴ－ＰＣＲ检测，各病毒检出率分别为３４．８％，１０．４％，２０．０％，４１．７％，２７．０％，７．８％，２．６％，１．７％，０，０．９％。表明除ＰＮＲＳＶ外，其他９种病毒在山东各地均有发生，且ＣＭＶ和ＴＭＶ发病率较高，２种或２种以上病毒复合侵染也很普遍。同时为明确山东地区ＣＭＶ分离物的株．．．

为了明确引起天津地区番茄果实褐化的病因,采用小RNA深度测序技术和RT-PCR技术对采自天津的番茄病样进行鉴定分析。结果表明,引起天津地区番茄果实变褐的病原为番茄花叶病毒。进一步对该病毒进行了全基因组测序,并对该病毒的外壳蛋白(CP)、运动蛋白(MP)和126蛋白进行了序列分析。进化树分析结果表明,天津分离物的3个蛋白基因均与美国分离物USA_99-1)的进化关系最近。相似性分析结果表明,CP基因与其他分离物的平均相似性为95.53%。MP基因与其他基因分离物的平均相似性为95.21%。126蛋白基因与其他分离物的平均相似性为92.72%。对这3个基因编码的蛋白进行分析,结果表明,不同分离物之间的平均相似性均在99.0%及以上。初步表明,在天津发生的番茄花叶病毒可能是由于贸易活动由国外传入天津市。

【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并测定其对黄瓜、葫芦和西瓜的致病性,为CGMMV的防控提供理论依据。【方法】从广东省连州市葫芦种植基地采集2个疑似CGMMV侵染的病样以及1个无症状样品,提取总RNA,根据CGMMV参考序列(GenBank登录号:KX883801)设计引物进行RT-PCR检测,引物序列为F:CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG/R:TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT,退火温度53℃,扩增长度890 bp。将CGMMV全长序列分为前后两段,前半段1—3 511 nt,扩增引物序列为F:AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTAATTTTTATAA TTAAACAAA/R:AGTTCTGCATTAATTGCTATTTGGTAGGCACAGTGGTAG;后半段3 301—6 423 nt,扩增引物序列为F:GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGATTGCCCGTG/R:GGTGGAGATGCCATGCCGACCCTGGGCCCCTACCCGGGGAAAGG。将前后两段PCR产物通过同源重组的方法克隆到pCB301双元载体上,测序得到CGMMV-GDLZ分离物全长序列。利用CGMMV-GDLZ分离物全长序列在NCBI中进行Blast分析,然后通过MEGA7软件对CGMMV-GDLZ以及其他已经报道的CGMMV分离物进行系统进化树分析。将构建好的pCB301-CGMMV侵染性克隆注射接种本生烟验证其侵染性,然后再注射接种黄瓜、葫芦和西瓜的子叶,测定CGMMV-GDLZ分离物的致病性。【结果】RT-PCR结果证实,广东省连州市葫芦病样感染了CGMMV。CGMMV-GDLZ分离物全长序列为6 423 nt,编码4个蛋白,分别为129K复制酶(61—3 495 nt)、186K复制相关蛋白(61—5 007 nt)、运动蛋白MP(4 994—5 788 nt)和外壳蛋白CP(5 763—6 248 nt)。CGMMV-GDLZ核苷酸序列与CGMMV-eWT分离物(GenBank登录号:KY753928)同源性最高,为99.97%。系统进化树分析结果显示,CGMMV-GDLZ分离物与日本、韩国等东亚CGMMV分离物同属Group 1,在遗传距离上与山东、浙江和河南的CGMMV分离物最接近。pCB301-CGMMV侵染性克隆可以系统侵染本生烟,造成本生烟上部叶片出现皱缩、斑驳、凸起等症状,RT-PCR和Western blot进一步确认了侵染性克隆的侵染性。注射接种CGMMV-GDLZ分离物后15 dpi,葫芦和西瓜即可产生斑驳、花叶、突起、生长迟缓等症状,24 dpi时症状更明显。而15 dpi时,CGMMV-GDLZ分离物在黄瓜上的症状不明显,与未接种对照植株几乎没有区别;将植株从控温接种室移入网室中,30 dpi时,黄瓜植株上部叶片开始出现斑驳和花叶,40 dpi时,症状已经非常明显。RT-PCR和Western blot检测进一步确认了上述结果。【结论】侵染广东省连州市葫芦的CGMMV-GDLZ分离物与山东、浙江和河南的CGMMV分离物很可能具有相同的传染源;CGMMV-GDLZ分离物可以侵染本生烟、黄瓜、葫芦和西瓜等作物,但对这些作物的致病性存在差异。

根据GenBank上登录的黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)外壳蛋白基因保守序列,设计特异性引物,利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)和免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR)技术对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行检测.结果表明,TC-RT-PCR和IC-RT-PCR均具有良好的特异性,检测灵敏度分别比DAS-ELISA高10和100倍;通过对一批进境黄瓜样品的检测,验证了2种检测技术的实际应用效果.因此,本研究建立的TC-RT-PCR和IC-RT-PCR检测技术,可有效应用于CGMMV的快速检测.

黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是我国的检疫性有害生物,在广西、辽宁、河北、山东、广东和北京等地均发现疫情,已严重威胁着西瓜、甜瓜、黄瓜等作物的生产,因此加强该病毒的检测极为重要。目前黄瓜绿斑驳花叶病毒病的检测主要有生物学检测、血清学检测、分子生物学检测及电镜显微观察等方法。笔者对有关黄瓜绿斑驳花叶病毒病的检测技术进行了综述,并分析了现有检测技术的优缺点和应解决的主要问题,探讨了该病毒检测技术今后发展的方向。

黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒是世界性分布的重要植物病毒,对农业生产危害较大。农作物感病多为复合侵染,症状表现较为复杂,急需建立快速、准确、能够一次检测多种病毒的检测方法。本研究根据3种病毒的外壳蛋白基因序列,设计引物和探针,制备基因芯片;用Cy3标记下游引物,RT-PCR扩增产物与芯片杂交,荧光扫描仪检测并分析信号。结果表明,该芯片可以从病毒侵染样本中检测到特异性识别信号,检测灵敏度比RT-PCR高10～100倍,该技术能对植物病毒做出快速、准确的检测。

及时剔除带毒烟苗是防控烟草花叶病的重要一环,该研究采用TAS-ELISA检测与电镜负染色法复检相结合,对2011年红河烟区1308份苗期样品进行TMV检测。结果表明,红河烟区不同育苗点烟苗TMV检出率差异较大,平均检出率为2.52%;不同烤烟品种烟苗带毒率也有差异,烟苗TMV阳性率与品种的抗性无直接相关性,而与育苗地点和育苗环境有关。该研究对筛选无毒壮苗,切断TMV传播途径、减少TMV对大田烟苗的感染具有重要意义。

烟草花叶病毒在烟草种植上为害严重。在烟草育苗前期,对育苗基质、水源、漂盘残根、育苗棚周围植物及烟草种植区病株残体、土壤用烟草花叶病毒TAS-ELISA试剂盒检测。结果表明,在水源、漂盘残根、烟草种植区病株残体、土壤中均可检测到烟草花叶病毒,在育苗棚周边8个科的14种植物中检测到烟草花叶病毒,此类毒源可能成为苗期烟草花叶病发生蔓延的初侵染源。

【目的】鉴定福建果园西番莲上的夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,Te MV),并建立用于该病毒特异性检测的分子快速检测方法,为该病毒的防治提供参考依据。【方法】采用血清学检测、电镜观察、通用简并引物RT-PCR、特异性引物RT-PCR对福建西番莲样品进行病毒检测,并对阳性样品的PCR产物进行克隆、测序;根据已报道的夜来香花叶病毒基因序列和本研究的序列测定结果,设计一对用于扩增Te MV外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长的特异性引物,通过反应条件优化,建立该病毒的特异

为从分子水平鉴定山东聊城的一表现明显花叶、黄化、蕨叶及果实畸形的南瓜病毒病的病原。采用RT-PCR的方法,用TMV外壳蛋白(CP)基因的特异引物,对该样品进行了检测,克隆到的基因序列进行分析,并使其在大肠杆菌中表达。结果表明,从该样品中扩增到了TMV的CP基因,说明该样品受到TMV的侵染,首次发现TMV自然侵染南瓜。对CP基因序列测定及分析表明,与GenBank上其他TMV分离物CP基因核苷酸序列的同源性为86.5%～99.0%,推导的氨基酸序列同源性为93.7%～99.4%。根据完整CP基因核苷酸序列构建的系统进化树显示:32个TMV分离物可分为5个组,其中TMV-liaocheng与Nak...

建立了豇豆两种种传病毒豇豆花叶病毒(CPMV)和黑眼豇豆花叶病毒(BlCMV)RT-Realtime PCR检测方法以及双重RT-Realtime PCR检测方法。在此基础上,根据免疫学抗原抗体特异性吸附的特点,建立了CPMV和BlCMV免疫捕获反转录荧光定量(IC-RT-Realtime)PCR检测方法以及双重IC-RT-Realtime PCR检测方法。该单重及双重IC-RT-Real-time PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和稳定性好等优点,适用于豆类种苗中对CPMV和BlCMV的检测。

为了培育无病毒壮苗,研究了烟草漂浮苗烟草花叶病毒(TMV)的带毒率检测方法.结果表明:三抗体夹心法(TAS-ELISA)和试纸条的检测灵敏度分别为TMV病叶汁液10-6和10-4;苗期常用农药和消毒剂的药害不会引起TAS-ELISA和试纸条检测假阳性;TAS-ELISA和试纸条可检出烟苗无症带毒,在发现烟苗现症时,同盘烟苗带毒率高于发病率;在允许存在低漏检率的情况下,采用2株或3株苗样本混合检测可扩大检测覆盖面;烟苗带毒是大田普通花叶病毒病的一个主要但非惟一初侵染源.