为明确植物光合作用中镁离子螯合酶ＣＨＬＩ与ＣＨＬＤ亚基形成复合物ＣＨＬＩ－ＣＨＬＤ这一重要过程的机制，首先需要获得可溶性ＣＨＬＩ和ＣＨＬＤ蛋白并确定其复合体装配。通过分子克隆技术构建截断的ＣＨＬＩ和ＣＨＬＤ重组体表达质粒。将其分别转化至大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，添加异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）进行诱导表达。通过ＮＩ琼脂糖树脂（ＮＩ ｓＥＰＨａｒｏｓＥ ６ ＦａｓＴ ＦＬｏｗ）和谷胱甘肽琼脂糖树脂（ＧＬｕＴａＴＨＩｏＮｓＥＰＨａｒｏｓＥ ４ ＦａｓＴ ＦＬｏｗ）亲和层析纯化可溶性重组蛋白。采用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｓＤｓ－ＰａＧＥ）和ＴＥＶ酶切试验验证目标蛋白。采用．．．

以菊花品种‘清露’cDNA为模板克隆出了菊花CmCSN1基因,并研究了CmCSN1在环境信号中的表达变化。序列分析表明:该基因编码442个氨基酸,推导的蛋白质相对分子质量为50 397;CmCSN1基因在进化上是保守的,具有与动物相同的PCI结构域。荧光定量PCR分析结果显示:该基因在根、茎、叶和花中都有表达,但花中的表达量较高;弱光处理使CmCSN1表达量上调;CmCSN1白天比晚上的表达量高,有昼夜节律性;在花发育过程中,萌动期表达量很低,而紧蕾期表达量急剧增加,表明该基因可能在弱光胁迫响应以及花发育方面发挥作用。

以甘蔗叶片总ＲＮＡ为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增细胞色素ｂ６－ｆ复合体铁硫亚基基因的Ｃ ＤＮＡ，采用生物信息学软件分析所克隆基因的编码蛋白特性，并用荧光定量ＰＣＲ分析该基因的表达情况。结果表明：克隆得到的Ｃ ＤＮＡ片段长度为７９６ ｂＰ，包括１个５７９ ｂＰ的开放阅读框，编码１９２个氨基酸。甘蔗与高粱ＣＹＴ基因Ｃ ＤＮＡ序列的同源性为９４．０％，氨基酸序列同源性为９９．０％；该基因推导的蛋白分子量大小为２０．６７ＫＤ，等电点为６．２４，疏水性分值在０．５０～２．１１；蛋白二级结构中α－螺旋占１７．１９％，随机卷曲占５３．１２％，延伸链占２１．５３％，β－转角只占８．３３％，ＧｅＮ ｂＡＮＫ登录号．．．

利用原核细胞表达羊口蹄疫病毒(FMDV)受体整联蛋白β6亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白。以含有羊整联蛋白β6亚基全长cDNA的质粒为模板,PCR扩增得到β6LBD基因片段,经酶切消化处理后与同样酶切处理的原核表达载体pPROEXTMHTb相连,构建原核表达质粒pPRO/β6LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导表达重组羊β6LBD融合蛋白。SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达并利用镍离子亲和树脂对其纯化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot方法分析鉴定表达产物。成功构建了pPRO/β6LBD原核表达载体,实现了羊...

【目的】研究松墨天牛ATP合成酶D亚基基因的鉴定及其表达特性,为开展昆虫ATP合成酶基因研究提供分子信息和参考,为深入研究ATP合成酶基因在松墨天牛中的生理、毒理作用奠定基础。【方法】对从松墨天牛c DNA文库中克隆的一条表达序列标签(EST)进行3'c DNA末端快速扩增,将获得的扩增序列与c DNA文库中的序列进行拼接,经开放阅读框(ORF)检索和Blast同源比对鉴定基因;用Prot Param tool软件分析基因编码的蛋白质性质,用DNAMAN软件构建系统发育树,用实时荧光定量PCR分析基因在不同虫态、成虫各部位和幼虫组织中的表达特性。【结果】获得了1条长度为1 133 bp的c D...

坎氏弧菌(Vibrio campbellii)是水产养殖动物的重要致病菌。本研究构建了坎氏弧菌热不稳定溶血素(TLH)基因的重组表达质粒pET26b(+)/tlh,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达带有6个组氨酸的TLH融合蛋白,然后利用Ni琼脂糖亲和层析柱进行纯化。SDS-PAGE分析显示,该溶血素能够大量表达,分子量约为42kD。纯化的TLH(0.41mg/mL)具有较强的溶血活性(溶血圈直径为16mm)及磷脂酶活性(晕圈直径为15mm)。其溶血活力的最适温度为37℃,在75℃下培养30min即丧失活力;最适pH为6,pH大于或小于6时都会导致其稳定性下降;一价金属离子如Na+、K...

【目的】克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因(mitochondrial F1-ATPase beta subunit gene),并分析该基因在龙眼体胚发生过程中的表达情况。【方法】采用RT-PCR结合RACE法,通过T/A克隆测序,获得龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因全长序列;随后通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达规律。【结果】成功克隆龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因完整cDNA序列(GenBank登录号:FJ222749),该序列全长2099bp,由1677bp核苷...

【目的】明确衔接蛋白(adaptor protein)GcAP1复合体β亚基在苹果炭疽叶枯病菌(Glomerella cingulata)生长发育和致病过程中的功能,检测GcAP1β在该菌中的时空表达模式,并揭示其是否调控多聚半乳糖醛酸内切酶(endopolygalacturonase)基因CgPG1和CgPG2、果胶裂解酶(pectin lyase)基因pnl-1和pnl-2以及果胶酸酯裂解酶(pectate lyase)基因pelA和pelB的表达,为深入开展苹果炭疽叶枯病菌衔接蛋白在致病信号传导途径

【目的】对杨树腐烂病菌金黄壳囊孢胞外分泌复合体亚基CcExo70进行功能分析,探究其在杨树腐烂病菌生长发育及致病过程中的生物学功能,为深入了解杨树腐烂病菌致病机制以及制定病害防控策略提供科学依据。【方法】1)利用PCR技术克隆得到CcExo70基因的DNA序列; 2)通过生物信息软件对其编码的氨基酸序列进行特征分析并构建其同源基因的系统发育树; 3)通过PEG介导的遗传转化法得到CcExo70基因的敲除突变体及回补菌株; 4)通过PDA平板生长试验和PDB摇培试验,分析敲除CcExo70基因对该病菌生长发育、菌丝形态及H2O2胁迫响应的影响;通过对1年生欧美杨健康枝条烫伤接种的方法,测定CcExo70基因对该病菌致病性的影响; 5)利用荧光增白剂(CFW)、二氨基联苯胺(DAB)和FM4-64染剂探究各菌株中几丁质沉积、活性氧积累及内吞作用情况; 6)通过蛋白质组测序分析,筛选可能受CcExo70调控分泌的外泌蛋白。【结果】1)在杨树腐烂病菌中克隆得到了一个CcExo70基因,该基因全长1 992 bp,包含1个内含子,编码636个氨基酸。2)系统发育和序列比对分析表明,CcExo70与其他病原真菌的同源基因在进化上是高度保守的。3)利用遗传转化法筛选得到2个敲除突变体(ΔCcExo70-8、ΔCcExo70-9),并获得了回补菌株(ΔCcExo70/C)。4)表型分析发现,与野生型和回补菌株相比,CcExo70敲除突变体在菌丝生长、形态发生、氧化应激反应和致病力等方面存在显著的缺陷。5) CFW染色观察显示,野生型和回补菌株菌丝尖端存在明显的几丁质沉积,而敲除突变体菌丝尖端未见明显的几丁质沉积但菌丝隔膜异常增加。此外,共聚焦显微镜观察发现,与野生型和回补菌株相比,CcExo70敲除突变体的内吞作用显著延迟。6)蛋白组测序分析发现,8个候选的外泌蛋白在CcExo70敲除突变体胞外培养滤液中的含量显著低于在野生型胞外培养滤液中的含量(降低了50%以上),其中有4个候选的外泌蛋白(CcSP2、CcSP3、CcSP6、CcSP7)在胞外培养滤液中的含量显著高于其对应菌株的胞内含量,其中包括1个候选的效应分子(CcSP2)和2个糖苷水解酶(CcSP6和CcSP7),表明这4个外泌蛋白的分泌受到了CcExo70的调控。【结论】胞外分泌复合体亚基CcExo70在杨树腐烂病菌的生长、胁迫响应、内吞作用和致病性等方面起着重要的调控作用。

【目的】体外真核表达飞蝗(Locusta migratoria)几丁质脱乙酰基酶1和2(chitin deacetylase 1and 2,LmCDA1和LmCDA2)并测定其酶活性,为进一步明确飞蝗LmCDA1和LmCDA2在几丁质降解途径中的生理功能及研发新型绿色环保杀虫剂提供依据。【方法】使用BLASTP和SMART软件在线预测LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的结构域;PCR克隆获得目的基因LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的全长序列,并分别构建p Fast Bac-LmCDA

细胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase,COX)是线粒体内呼吸链电子传递的终末复合物,是线粒体氧化能力的关键调节物质。细胞色素C氧化酶亚基I(COXⅠ)是细胞色素C氧化酶具有酶催化活性的3个亚基之一。本研究以本实验室构建的青石斑鱼消减杂交cDNA文库中长587bp的EST序列为基础,采用RACE-PCR方法克隆鉴定出青石斑鱼(Epinephelus awoara)细胞色素C氧化酶亚基I基因。研究结果表明:青石斑鱼COXⅠ全长1659bp,5'端非编码区3bp,3'端非编码区105bp,开放阅读框1551bp,编码516个氨基酸。序列分析表明,青石斑鱼COXⅠ与线纹刺尾鲷COXⅠ同...

水稻新生多肽结合复合体α链（Ｏｓα－ＮＡＣ）基因家族共有３个成员，分别位于第１，３，５号染色体。为研究Ｏｓα－ＮＡＣ基因家族在逆境环境中的生物学功能，利用ＲＴ－ｑ ＰＣＲ和ＷｅｓＴｅＲＮ ＢｌＯＴ技术，详细分析了Ｏｓα－ＮＡＣ基因家族在不同组织中的表达情况，并进一步研究了Ｏｓα－ＮＡＣ基因家族对非生物胁迫的应答模式。结果表明，在高盐和模拟干旱条件下，Ｏｓ１ｇ ＮＡＣ和Ｏｓ５ｇ ＮＡＣ基因表达上调，Ｏｓ３ｇ ＮＡＣ基因表达下调，提示Ｏｓα－ＮＡＣ基因家族各成员在水稻响应非生物胁迫的过程中发挥不同的作用。上述试验结果初步阐明该基因家族在非生物胁迫下的表达特性，为今后更深入研究该基因家族的功能提供了．．．

兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室前期预测了新的ETT2伴侣分子YgeG,为了获得大量有活性的YgeG蛋白,对其功能进行鉴定,并筛选出与其相关的具有活性的ETT2分泌效应蛋白,将对目的蛋白原核表达条件进行优化。以禽致病性大肠杆菌菌株81(AE81)为模板对基因ygeG进行扩增,将扩增产物克隆至pGEX-6p-1原核表达载体,构建重组质粒pGEX-6p-1-ygeG,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化。SDS-PAGE及Western Blot鉴定结果显示,本试验中表达的最佳条件为:IPTG终浓度为0.25 mmol/L,16℃诱导16 h。重组蛋白大小约为44 ku,在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中高效表达,主要以可溶性蛋白的形式存在,并且具有良好的免疫原性和反应原性。成功表达了AE81-YgeG蛋白,为该蛋白的结构和功能及ETT2的深入研究奠定基础,为禽大肠杆菌病的防治提供理论依据。

为了深入研究GhCOMT3基因的功能,将GhCOMT3基因构建到原核表达载体pET-28a中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。用0.2mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,结果发现,16℃诱导12h、30℃诱导3h和37℃诱导3h后融合蛋白均以包涵体的形式表达;30℃诱导的蛋白表达量最大,之后对包涵体进行变性溶解,进行SDS-PAGE检测,再经过蛋白标记亲和层析柱(His TrapTMHP)纯化得到变性的pET-28a-GhCOMT3融合蛋白,用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化效果,鉴定表达产物,目的蛋白相对分子量约为39.119kDa,检测结果与预期一致。结...

以吸水链霉菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到谷氨酰胺转胺酶基因片段,构建pGEX-TGase重组质粒,并转化到大肠杆菌中得到重组菌BL21/pGEX-TGase。重组菌经乳糖诱导产生融合蛋白,并对诱导条件进行了优化。表达产物主要以包涵体形式存在,采取稀释及尿素梯度液相色谱结合的方法,成功地实现了包涵体蛋白的复性。通过GST亲和柱纯化目的蛋白,得到酶活为29U/mg的电泳纯目的蛋白。