简要介绍了钙依赖型蛋白激酶(Calcium-dependentProteinKinases,CDPKs)的结构特点及家族成员,重点对CDPKs在植物环境胁迫、防御反应、生长发育、离子通道调节和激素信号等方面的生理功能研究进展进行了综述和讨论,并展望了该领域的研究前景。

钙是植物必需的大量元素之一,同时钙离子(Ca(2+))是细胞信号转导的第二信使。钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase,CDPK)作为Ca(2+)的感受器普遍存在于植物和部分原生动物中,是植物特有的一类丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶,参与了多种Ca(2+)介导的信号通路,在植物发育信号和逆境信号转导中具有重要作用。本文概述了钙依赖蛋白激酶在植物体内的分布、结构、底物、功能以及大豆CDPK的研究进展,旨在为今后培育抗逆植物品种提供参考依据。

【目的】克隆强抗寒性牧草短芒大麦钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase,CDPK)基因,分析其生理生化特性,为理想抗逆工程基因的筛选和利用奠定基础。【方法】采用RACE-PCR技术,获得短芒大麦CDPK基因全长cDNA序列;采用Northern杂交分析该基因在逆境条件下(低温(4℃)、干旱(200 g/L PEG6000)、盐(300 mmol/L NaCl)、激素(100μmol/L ABA))的表达模式;采用农杆菌介导的方法,对该基因编码蛋白进行亚细胞定位,并对转基因烟草的离子渗漏率和脯氨酸含量进行测定。【结果】获得了短芒大麦CDPK基因的编码序列...

为探讨蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29)在蓖麻耐盐中的作用，以蓖麻叶片为材料，设计特异性引物，克隆蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29),并对所得序列进行生物信息学分析。结果表明，蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29)序列全长1 590 bp;编码528个氨基酸；蛋白分子量为59.74 ku;等电点(pI)值6.21;是典型的非跨膜蛋白；亲水性数值为负值，属于亲水性蛋白；RcCDPK29蛋白α-螺旋占比最高有228个；RcCDPK29与拟南芥CDPK(SMTL ID:3q5i.1)相似度为40.41%,具有较高可信度(>30%)。将木薯、麻枫树、巴西橡胶树、柑橘、石榴、毛果杨与蓖麻RcCDPK29氨基酸序列进行同源性比对。其中，与麻枫树的同源性最高，为82.29%。RcCDPK29蛋白包含1个Ser/Thr蛋白激酶催化结构域和4个与Ca~(2+)结合的EF-hand型结构域。通过qRT-PCR技术，分析RcCDPK29在不同水平盐胁迫下蓖麻不同组织中的表达，结果表明，RcCDPK29基因主要在茎中表达，盐处理12 h表达量最高。随着盐处理时间的延长，RcCDPK29基因根的表达量逐渐下降，分别在2,8,24 h达到最低，与0 h差异显著；叶的表达量在2 h的表达量最低且与0 h相比差异显著。根据RcCDPK29全长设计带有SmaⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物扩增出序列全长，用SmaⅠ和XbaⅠ进行双酶切后与表达载体pCG-3300连接。成功构建了CRcCDPK29的表达载体。因此，RcCDPK29在蓖麻受到盐胁迫时起重要作用。

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(CaMKⅣ)是一种广泛存在于真核生物中的调控因子,在生物体内具有多种生理功能。为了探究瘤背石磺中Ca MKⅣ的作用和分子机制,为进一步阐述Ca MKⅣ的生理功能提供科学的理论依据。本实验以瘤背石磺神经节为实验材料,利用RACE-PCR技术克隆得到CaMKⅣ基因的cDNA序列,并进行生物信息学分析和q RT-PCR实验。结果显示,瘤背石磺Ca MKⅣ基因的c DNA全长1 603 bp,开放阅读框为1 032bp,5′非编码区315 bp,3′非编码区256 bp,共编码343个氨基酸;预测该基因编码的多肽链原子数量是5 490,分子量约为3.87 ku,理论等电点6.12,分子式为C1741H2768N452O514S15,N端信号肽由1～29个氨基酸组成。氨基酸序列比对及系统进化树结果显示,瘤背石磺CaMKⅣ基因与加州海兔、光滑双脐螺CaMKⅣ基因的亲缘关系最为接近,其系统进化分析与传统的形态学分类相吻合。荧光定量PCR结果显示,CaMKⅣ基因在各个组织均有表达,其中在腹足的相对表达量最高,其次是背部皮肤、口器,而在神经节组织、蛋白腺、肠、肝胰腺等脏器组织的相对表达量较低,初步推测,该基因在瘤背石磺的神经调节中发挥重要作用,或为生物机体感知外界环境变量因素的分子基础。本实验为今后进一步了解瘤背石磺神经结构生理功能的调节以及与CaMKⅣ基因功能研究奠定理论支撑,也为探究海洋动物由海洋向陆地进化过程中对环境的适应机制提供参考。

为证实热休克小鼠胎儿成纤维细胞中钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)对热休克蛋白70(Heat shock protein70,HSP70)基因表达的影响及其作用机理,将体外培养的小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblasts,MEF)随机分为39℃和41℃热处理组(分别处理0.5,1,1.5,2 h)和常温对照组(37℃),测定各组细胞CaMKⅡ和HSF1 mRNA的量。此外,将培养的细胞分为37℃和39℃CaMKⅡ特异性抑制剂(myr-AIP)处理组和相应的空白对照组,分别测...

应用BLAST比对技术,在松材线虫基因组数据中鉴定得到模式线虫pdk–1的同源基因Bxpdk–1。结合RT–PCR技术进行Bxpdk–1基因完整蛋白编码区(CDS)扩增,得到CDS区全长2298bp。Bx PDK–1蛋白含有"STKc_PDK1""PH_PDK1"2个保守结构域,属于磷酸肌醇激酶超家族。序列比对及进化树分析显示,松材线虫Bx PDK–1蛋白与捻转血矛线虫PDK–1蛋白(CDJ88126.1)同源性为50%,进化树聚在同一小分支上,亲缘关系较近。原位杂交试验表明,Bxpdk–1基因主要在线虫的头部神经元及咽部神经处表达。q PCR结果分析显示,Bxpdk–1基因表达响应鱼藤酮药剂胁迫处理。RNAi试验显示,Bxpdk–1在dsRNA处理12 h时,基因表达量显著下降,基因被沉默。

【目的】筛选玉米蔗糖非酵解型蛋白激酶2(Sucrose non-fermenting protein kinase 2,SnRK2)的底物蛋白,鉴定其在玉米脱落酸(Abscisic acid,ABA)信号转导中的作用,为进一步解析玉米中ABA介导的非生物逆境抗性机制提供参考。【方法】根据前期研究结果,通过与拟南芥SnRK2已知底物蛋白的序列比对和保守基序分析,从磷酸化水平响应ABA诱导且上调的238个蛋白中预测ZmSnRK2作用的底物蛋白,用酵母双杂交试验验证ZmSnRK2家族成员与候选蛋白的相互作用,分析其在玉米ABA信号转导中的作用。【结果】从前期鉴定的玉米磷酸化水平响应ABA诱导且上调的238个蛋白中,预测出10个ZmSnRK2候选底物蛋白,实际扩增出其中8个蛋白的编码基因以及10个ZmSnRK2基因家族成员。酵母双杂交试验结果表明,GenBank序列号为XP_008666965.1、NP_001142137.1和XP_008656995.1的候选底物蛋白,因自体磷酸化不能用酵母双杂交检测,GenBank序列号为NP_001183680.1的候选底物蛋白可以与ZmSnRK2.1、2.2、2.4、2.5、2.7、2.8、2.10、2.11蛋白相互作用,GenBank序列号为NP_001145831.1和NP_001167942.1的候选底物蛋白分别可以与ZmSnRK2.1和ZmSnRK2.10蛋白相互作用。【结论】NP_001183680.1和NP_001167942.1蛋白是ZmSnRK2家族部分成员的磷酸化底物,是玉米ABA信号转导途径的下游组分;NP_001183680.1蛋白与拟南芥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶同源,NP_001167942.1蛋白为包含SAM结构域的蛋白,这2个蛋白均涉及许多生理生化过程,说明ZmSnRK2下游的ABA信号转导呈发散状。

【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA文库,通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2互作的蛋白,并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA为模板克隆得到TaMAPK2,构建pGBKT7-TaMAPK2诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaMAPK2质粒以及pGADT7和小麦cDNA文库共转化酵母AH109菌株感受态细胞,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上30℃培养3—5 d,挑选单克隆于YPDA培养基中培养,吸取1μL各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培养,筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分析,初步获得与TaMAPK2...

【目的】盐胁迫影响作物的产量和品质,而作物的耐盐性受特定基因的调控。在前期获得谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35过表达水稻株系的基础上,拟结合植株在盐胁迫下的表型,对部分盐胁迫指标及响应基因的表达模式进行检测和验证,解析谷子SiRLK35参与盐害响应的可能机制。【方法】选取谷子SiRLK35过表达水稻株系,分别为过表达株系(over-expression,OE)-1(OE-1)、OE-2和OE-3,以野生型中花11为对照,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测各株系中SiRLK35的表达情况;分别用含0、150和200 mmol·L~(-1) NaCl的MS培养液处理三叶期的对照及转基因株系幼苗,观察其表型,统计150 mmol·L~(-1) NaCl处理3d后苗长及根长;用150 mmol·L~(-1) NaCl处理四叶期幼苗,统计处理14 d后材料干重、死亡率和死叶率,对各材料的耐盐性进行评价;进一步挑选SiRLK35过表达程度高且耐盐表型好的OE-1株系,利用3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-Diaminobenzidine,DAB)和氮蓝四唑(nitrotetrazolium blue chloride,NBT)染色检测其胁迫下过氧化物积累及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化物酶(peroxidase,POD)的活性;并对部分盐害响应基因的表达模式进行检测。【结果】谷子SiRLK35在株系OE-1中的相对表达量最高;150 mmol·L~(-1)NaCl处理3 d幼苗后,中花11苗长和根长的生长受抑制程度均大于SiRLK35过表达株系,其中OE-1的受抑制程度最小;四叶期幼苗经150 mmol·L~(-1) NaCl处理14 d后,转基因株系地上部和地下部干重降低幅度均低于对照,且幼苗死亡率和死叶率均低于对照;盐胁迫下对照过氧化染色反应明显,O~(2-)和H_2O_2的积累均高于过表达植株,SOD和POD抗氧化酶活性均高于对照;部分盐害响应基因在SiRLK35过表达株系中表现为上调,其中,OsLEA3在盐处理24 h的相对表达量是对照中的1.9倍。【结论】谷子SiRLK35异源转化水稻获得的过表达株系对盐胁迫具有一定的抗性,SiRLK35可通过调控抗氧化酶活性及相关信号途径,从而参与盐害响应。

为了研究玉米蛋白激酶ZmSPK1在植物体内亚细胞水平上的分布情况,利用绿色荧光蛋白基因gfp为报告基因,分别构建了以35S为启动子表达ZmSPK1-GFP融合蛋白和GFP的植物表达载体35S∷ZmSPK1-GFP和35S∷GFP,用花粉浸醮的方法将表达载体转入拟南芥,筛选稳定表达株系,在共聚焦激光扫描显微镜下观察ZmSPK1在植物细胞中的定位。研究结果表明:融合蛋白ZmSPK1-GFP的荧光分布与游离GFP相似,在细胞浆及细胞核内均可见。与单独表达GFP相比,融合蛋白ZmSPK1-GFP在核内信号更强,推测ZmSPK1是可溶性蛋白,定位在核内。

为了研究烟草中蛋白激酶CIPK3在植物非生物胁迫应答中的功能,通过同源克隆的方法,在普通烟草品种K326中克隆到1个CIPK家族基因NtCIPK3。利用生物信息学软件对该基因编码蛋白的结构和功能进行了预测分析。该基因包含一个1 272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸残基。蛋白序列分析表明,该蛋白含有一个跨膜结构域,且平均疏水性系数小于0,属于亲水性膜蛋白。蛋白比对分析发现,NtCIPK3含有高度保守的N端激酶区、连接区以及C端调控区,与野生烟草CIPK3的同源性最高,达99%。亚细胞定位预测显示,该蛋白主要定位于细胞核,且具有双分型的核定位信号序列。运用qRT-PCR技术,对该基因的表达特性进行了分析,组织表达分析发现,该基因在烟草的根、茎、叶、花中均有表达,但在叶中表达水平明显高于其他组织,推测可能主要在叶中行使功能。NtCIPK3基因在不同程度上受低钾、高盐、干旱、ABA、H_2O_2、低温处理的诱导,推测NtCIPK3基因在烟草的非生物胁迫应答反应中发挥了重要作用。并成功构建pBI121-NtCIPK3过表达载体,为今后该基因在非生物胁迫下的功能研究奠定了基础。

为了解不同类受体蛋白激酶RLKs激酶域响应病原相关分子PAMPs信号强度的差异,本研究将拟南芥FLS2的胞外域(NT)与6种不同RLKs的激酶域(KD)组合为重组RLKs(rRLKs),构建融合基因表达载体,并通过拟南芥原生质体瞬时表达的方法,将rRLKs/FLS2、35S::GUS(内参)和FRK1::Luciferase(响应报告载体)共转化到拟南芥fls2突变体叶肉原生质体细胞中;后经flg22处理后,通过对萤光素酶(Luciferase)和葡糖苷酸酶(GUS)活性的定量分析和比较,鉴定不同RLKs

为研究LHK1蛋白的功能,构建了pPub-LHK1∶AG-GFP和pFastBac-LHK1表达载体,分别在烟草叶肉细胞和昆虫细胞表达百脉根组氨酸蛋白激酶LHK1跨膜蛋白。结果表明:在烟草和昆虫细胞中LHK1蛋白都能表达,且表达的蛋白在体外都能磷酸化底物(组氨酸转移酶HP1蛋白),具有组氨酸蛋白激酶活性。

【目的】在葡萄中克隆丝苏氨酸蛋白激酶ＶＶ ＣＩＰＫ１０，分析其激酶特性和在逆境胁迫下的表达模式，为进一步研究该基因参与逆境胁迫的分子功能，探讨葡萄抗逆分子机制提供理论依据。【方法】利用电子克隆技术获得ＶＶ ＣＩＰＫ１０序列，设计特异引物进行ＲＴ－ＰＣＲ反应，对克隆到的序列进行开放阅读框和保守结构域分析；构建原核表达载体，转化表达菌株后用ＩＰＴＧ进行诱导表达，收集菌体后裂解细胞，制备蛋白上样液，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳对表达产物进行分析，同时对融合蛋白进行可溶性分析；ＩＰＴＧ大量诱导表达融合蛋白，收集菌体后进行超声破碎细胞，用麦芽糖结合蛋白纯化柱纯化ＭＢＰ－ＶＶ ＣＩＰＫ１０融合蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧ．．．