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[期刊] 中国农业科学
[作者]
李艳 仇华吉 王秀荣 张守发 朱庆虎 李娜 李国新 童光志
【目的】建立一种能区分猪瘟病毒(classicalswinefever,CSFV)强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法。【方法】根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列,选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物,并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物,建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。【结果】应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段,但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
陈信忠 苏亚玲 龚艳清 黄丽莎 俞秀霞 苏永全
神经坏死病毒(Nervousnecrosisvirus)是导致多种海水鱼类神经性病害的致病原。发病及死亡的石斑鱼除了表现神经异常症状外,无明显的临床病症,体表及内脏组织也未发现明显病变及寄生虫感染。2003年4～8月,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从福建南部人工养殖的5种石斑鱼即紫石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)、马拉巴石斑鱼(E.malabaricus)、青石斑鱼(E.awoara)、赤点石斑鱼(E.akaara)和云纹石斑鱼(E.moara)中检出5个神经坏死病毒分离株。检测了76份石斑鱼样品,这些石斑鱼NNV病毒的平均感染率约为90%。对这些病毒的RT...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
郑艳萍 Chander Subhash 杨小红 周俊青 李建生 严建兵
SNP是具有广泛利用潜力的第3代分子标记,本文旨在开发一种利用PCR技术快速检测SNP的方法。设计思路是:根据已知SNP位点设计2条特异正向引物,其最后一个碱基分别与已知SNP的2个碱基相同,同时在1条引物的5′端添加1段20 bp左右的其他物种的特异序列(如细菌DNA序列),然后选择1条合适的反向引物;最后同时加入3条引物,通过梯度PCR选择合适的退火温度进行PCR反应。利用这一方法成功将玉米的ZDS基因定位在玉米第7染色体短臂7.02 Bin。这种检测SNP的方法设计简单,费用低廉,尤其适合SNP标记的分子标记连锁图构建或者基因定位。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭抗抗 邓力 井勇 张彦明 王晶钰 宁蓬勃
【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
吴旭锦 朱小甫
【目的】建立一种基于E0基因高保守性的猪瘟病毒(CSFV)RT-nPCR检测方法,为临床诊断提供一种可靠方法,同时对获得的陕西猪瘟病毒E0基因进行序列分析,揭示猪瘟病毒基因的分子衍化特征,为防控猪瘟提供参考。【方法】根据GenBank中的猪瘟病毒参考序列,设计并合成了2对引物,建立猪瘟RT-nPCR检测方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行检测。用该方法对采自陕西部分猪场的32份疑似猪瘟病料进行检测,并对获得的8株流行毒株E0基因进行测序及同源性分析。【结果】建立了猪瘟病毒RT-nPCR检测方法,该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为6.7×10-5 ng/L,从BVDV、PRRSV、PC...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
吴旭锦 朱小甫
【目的】建立一种基于E0基因高保守性的猪瘟病毒（CSFV）RT-nPCR检测方法，为临床诊断提供一种可靠方法，同时对获得的陕西猪瘟病毒E0基因进行序列分析，揭示猪瘟病毒基因的分子衍化特征，为防控猪瘟提供参考。【方法】根据GenBank中的猪瘟病毒参考序列，设计并合成了2对引物，建立猪瘟RT-nPCR检测方法，并对该方法的灵敏度和特异性进行检测。用该方法对采自陕西部分猪场的32份疑似猪瘟病料进行检测，并对获得的8株流行毒株E0基因进行测序及同源性分析。【结果】建立了猪瘟病毒RT-nPCR检测方法，该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为6.7×10-5 ng/L，从BVDV、PRRSV、PC...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
柴下 陆宏达 刘俊杰 岳蒙蒙 卢德刚
应用巢式聚合酶链反应(nested PCR)建立了一种检测异育银鲫武汉单极虫(Thelohanellus wuhanensis)基因组DNA的方法,提取的DNA作为模板进行两次扩增,第一次扩增用单极虫18S rRNA序列通用引物:5'-CTGCGGACGGCTCAG TAAATCAGT-3'和5'-CCAGGACATCTTAGGGCATCACAGA-3',扩增长度为1 584 bp;第二次依据第一次扩增产物中武汉单极虫特有的高度保守区设计特异性引物:5'-ACCCACTTCTGTGGC CTTTC-3'和5'-AATCCGACCTACAACGCTGG-3',扩增长度为853 bp。结果表明,通...
[期刊] 水产学报
[作者]
高文辉 白昌明 蔡生力 王崇明
为了建立适用于Ｏｓ ＨＶ－１不同变异株的检测方法，在牡蛎疱疹病毒（Ｏｓ ＨＶ－１）３个变异株全基因组序列比对的基础上，筛选到牡蛎疱疹病毒基因组中高度保守的ＤＮＡ聚合酶（ＤＮＡ ｐＯｌｙｍｅｒＡｓｅ）基因，据此设计巢式ｐＣｒ引物，优化ｐＣｒ反应体系和条件，建立了基于Ｏｓ ＨＶ－１ ＤＮＡ聚合酶基因的巢氏ｐＣｒ检测方法（ｐ－Ｎ ｐＣｒ检测方法），利用ｐ－Ｎ ｐＣｒ与ＣＮ ｐＣｒ检测方法对不同年份和宿主来源的Ｏｓ ＨＶ－１疑似感染样本进行检测。结果显示，ｐＮ ｐＣｒ检测方法能稳定地检出１００拷贝／μｌ的病毒ＤＮＡ；ｐ－Ｎ ｐＣｒ较Ｃ－Ｎ ｐＣｒ检测方法具有更强的特异性和更高的检出率。研究表明，本研究．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
邓力 张彦明 李维维 杨幼聪 谭晓妮
【目的】建立一种能够实际应用于猪瘟兔化弱毒疫苗中猪瘟病毒含量检测的荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中登录号为AF091507的猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒株的全长基因组序列,在其5′非编码区设计2对特异性引物(标准品引物、定量引物)和1条探针(qPCR-P),通过标准品引物进行RT-PCR扩增及T7 RNA聚合酶体外转录构建标准品RNA。对荧光定量PCR方法的各项条件进行优化,建立猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR检测方法,并采用该法对成品猪瘟兔化弱毒疫苗中的病毒含量进行检测。【结果】成功构建了体外转录的标准品RNA,建立了检测猪瘟兔化弱毒的荧光定量PCR方法。该方法检测灵敏度可达10拷...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
植爱萍 柳勤海 赵紫馨 肖轩仪 张洋 陈莉 冯明峰 朱敏 陶小荣
[目的]新德里番茄曲叶病毒（tomatoleafcurlNewDelhivirus，ToLCNDV）严重威胁我国茄科和葫芦科作物的生产，本研究旨在建立针对该病毒的快速检测方法，为病害的监测和防控奠定基础。[方法]针对ToLCNDV基因组A的保守区域设计了两对特异性引物，经过筛选后选用其中一对引物建立了针对ToLCNDV的重组聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification， RPA）检测方法。[结果]该方法可在42℃恒温条件下，仅用30 min完成对ToLCNDV的指数级扩增，扩增产物既可通过琼脂糖凝胶电泳进行观察，又能通过测流层析试纸条实现检测结果的快速可视化。经特异性检测发现，本研究所建立的RPA技术可特异性地检出ToLCNDV，而检测不到番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus， TYLCV）、番茄金色花叶病毒（tomato golden mosaic virus， TGMV）、云南番茄曲叶病毒（tomato leaf curl Yunnan virus， TLCYnV）和中国南瓜曲叶病毒（squash leaf curl China virus， SLCCNV）等侵染茄科和葫芦科作物的其它DNA病毒。另外，在测试灵敏度时发现，当模板DNA浓度稀释到5×10-7 ng时RPA仍能检测为阳性结果，而常规聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）检测的最低模板含量仅为0.05 ng，说明RPA检测ToLCNDV的灵敏度显著高于常规PCR。[结论]本研究所研发的ToLCNDV快速检测方法为建立该病毒的早期监测预警和综合防控技术体系奠定了基础。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
汪俊 薛长湖 李兆杰 蔡跃飘 何闪闪 杨文鸽
利用pH9.5的甘氨酸缓冲液性处理太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)匀浆液,PEG沉淀病毒粒子的方法对未知的是否污染有诺瓦克样病毒(Norwalk-like Virus,NLVs)的牡蛎样品进行处理,并提取病毒RNA,进行RT-PCR,凝胶电泳检测扩增结果。初步建立了牡蛎中NVLs的检测方法。纯化所得的特异PCR产物,克隆到T-载体中,筛选转化子,提取质粒,并进行PCR电泳鉴定。重组质粒序列测定结果在NCBI上进行BLASTn显示所得产物与已发表的诺瓦克样病毒的相应序列具有极高的同源性(>95％);根据Genebee在线分析系统AliBee-Multiple Alignment进...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱小甫 张志 李晓成 陈德坤 吴旭锦
为了优化猪瘟病毒的RT-nested PCR检测方法,对福建省猪瘟流行情况进行了调查。根据GenBank上发表的猪瘟病毒Shimen株基因序列设计并合成了2对引物,优化了猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的RT-nested PCR检测方法,并对所优化的RT-nested PCR特异性进行了检验。结果表明,该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为1×10-7ng/mL,只有CSFV扩增出了272 bp的目的条带,从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)阳...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘辉 熊金凤 邹浩勇 陈杨 杨维红 何启盖
根据猪瘟病毒(CSFV)的E2基因保守序列、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因及部分ORF6和3-UTR基因序列和猪乙型脑炎病毒(JEV)的E基因保守序列,设计了3对引物,扩增大小分别为288 bp4、30 bp和1 015 bp目的片段。以纯培养病毒抽提RNA,制备cDNA模板,利用3对引物,通过条件的优化,建立了同时检测这3种病毒的多重RT-PCR。CSFV、PRRSV和JEV的RNA最小检出量分别为0.270 ng、0.049 ng、0.067 ng,其它的RNA病毒如TGEV以及DNA病毒如PPV、PrV、PCV-2检测结果为阴性。以-βactin为对照,利用本方法...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
朱山 郭福生 涂小林 陆承平 吴时友
聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测证明，某虾场发病的中国对虾（Ｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）感染无包埋体对虾病毒（ＮＯＳＶ），或称中国对虾类杆状病毒（ＰｃＢＬＶ）；野生脊尾白虾（Ｅｓｏｐａｌａｅｍｏｎｃａｒａｉｎｉｃａｕｄａ）也感染ＮＯＳＶ，并可能经卵垂直传播；南美白对虾（（Ｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ）亦可感染该病毒而发病。经ＰＣＲ扩增纯化的皮下及造血组织坏死症杆状病毒（ＨＨＮＢＶ）与ＮＯＳＶ的核酸结果表明，两者为同一种病毒。选取经ＰＣＲ检测的９份样品，重新编号后用ＥＬＩＳＡ法进行检测，两种方法判定的结果完全相同。将ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ双阳性的样品制备超薄切片，观察到ＮＯＳＶ感染的典型细胞病变。...
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