【目的】对浙江地区采集的野生桑黄菌株进行鉴定和系统发育分析,并探讨其培养特性,为进一步开发利用桑黄菌提供科学依据。【方法】利用核糖体基因rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列并结合形态学特征,对野生桑黄菌株(编号SA-1)进行鉴定;基于ITS1-5.8S-ITS2序列,对菌株SA-1和桑黄孔菌属的桑树桑黄、高山桑黄、锦带花桑黄、杨树桑黄、环区桑黄、小孔忍冬桑黄、暴马桑黄共8个菌株进行亲缘关系和系统发育分析;设置不同碳源、氮源、无机盐、温度和pH开展单因素试验,分析各培养因子对桑黄菌株菌丝生长的影响,并运用L_9(3~4)正交试验对培养条件进行优化。【结果】根据菌株形态学特征和rDNA ITS序列分析,将野生菌株SA-1鉴定为桑树桑黄(Sanghuangporue sanghuang),但其与桑黄孔菌属中其他6个菌株的遗传距离较远。系统发育进化树结果显示,桑树桑黄和菌株SA-1聚为一类(bootstrap=100%),其他6个菌株聚为另一类。单因素试验确定SA-1菌丝生长的适宜培养温度为27.5℃,最适pH为7.0,最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为蛋白胨,最佳无机盐为KH_2PO_4;经正交试验得到最适培养条件为可溶性淀粉20 g/L,蛋白胨4 g/L,KH_2PO_4 1 g/L,培养温度30℃。【结论】确定浙江地区采集的野生桑黄菌株为桑树桑黄(S.sanghuang),并初步筛选出了该菌株的适宜培养条件。

以野生黄木香茎段为外植体,探讨了不同生长调节物质对其不定芽诱导、增殖和生根的影响,并建立了野生黄木香的高效再生体系。结果表明,利于野生黄木香分化的诱导培养基为M S+A gNO33.0 m g/L+6-BA1.5 m g/L+NAA 0.5 m g/L+琼脂6.5 g/L+蔗糖30 g/L;以M S+A gNO33.0 m g/L+6-BA 1.5 m g/L+NAA0.05 m g/L+琼脂6.5 g/L+蔗糖30 g/L为增殖培养基时的增殖效果最好,增殖倍数为5.5;黄木香高效的再生体系为1/2 M S+A gNO34.5 m g/L+IBA 0.2 m g/L+质量分数0.2%活性炭+琼...

【目的】研究野生猪苓菌株的最佳分离、培养方法,为猪苓的深入研究和人工栽培提供参考。【方法】对采自陕西眉县太白山野生猪苓进行菌核组织分离和子实体孢子分离,比较2种方法所得菌株菌丝的生长情况。以子实体孢子分离所得菌株为材料,分析不同培养基、碳源、氮源、生长因子、矿质元素和栽培代料对其菌丝生长的影响。【结果】采用子实体孢子分离法所得猪苓菌株菌丝生长情况较菌核组织分离法好;PDA培养基、GPY培养基和麦芽汁培养基适用于野生猪苓菌的分离。分别以糊精、果糖为碳源,蚕蛹粉、酪素为氮源时,它们对猪苓菌丝生长的促进作用都非常显著;以1.2mL/L玉米浆作为生长因子时,菌丝生长速率最高。适宜质量浓度的矿质元素对猪...

采用根瘤切片法从广西本地杨梅根瘤中分离获得3株内生菌,经镜检、革兰氏染色和BAP无氮培养基培养,证实这3株内生菌为Frankia sp.,分别命名为MF3、MF6和MF9。对这3株分离株在不同碳源、氮源和pH值的培养特性进行研究。结果表明,3株分离株在分别以吐温-80、葡萄糖、丙酸钠为碳源的BAP培养基上生长良好,3株分离株对琥珀酸钠的利用较差;适宜的氮源为酵母膏、酪蛋白和氯化铵,尿素的利用率低。3株分离株均适合在pH 5.5～6.5范围内生长,pH 7.0以上生长受到抑制。

为进一步了解芦荟黑斑病的发生规律,采用组织分离法、血球计数板法、悬滴法等对病原菌进行了形态鉴定及其培养特性的研究。结果表明,芦荟黑斑病的病原菌为倒梨形链格孢(Alternaria obpyriformisT Y Zhang)。该菌菌丝生长和分生孢子产生的温度范围为10~30℃,最适温度为25℃;在pH 3.92~10.82的范围内该菌均能生长和产孢,菌丝生长最适pH 3.92~6.83,产生分生孢子的最适pH 5.23~6.83;分生孢子萌发的温度范围为10~35℃,最适20~30℃,最适pH 3.86~9.23。分生孢子在饱和湿度或水滴中萌发快,相对湿度低于81%时不能萌发。分生孢子的致死温...

【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37℃、5%CO_2细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈"S"型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点(P<0.01)。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。

以分离自竹黄菌天然子座的LBR-SB6菌株为出发菌株,通过对形态特征、培养特性的研究,确定了该菌株为曲霉菌属Aspergillus sp.以改良查氏培养基为基础,对LBR-SB6液态发酵碳氮源等条件作了初步探讨,结果表明:乳糖、麦芽糖和玉米浆、亚硝酸钠分别是菌株生长和产色素的最佳碳源和氮源,1.0%竹汁对菌株生物量和色素生成量具有明显的促进作用.最终确定了LBR-SB6菌株液态发酵培养的最佳条件为:乳糖2%,亚硝酸钠0.2%,玉米浆0.1%(以干物质计),1.0%竹汁,磷酸氢二钾0.1%,硫酸镁0.025%,氯化钾0.5%,硫酸亚铁0.001%;最适温度25~28℃,摇床转速150~200 r...

以牡竹属黄竹（ＤｅｎｄｒｏｃａｌａｍｕｓｍｅｍｂｒａｎｃｅｕｓＭｕｎｒｏ）的竹节及无菌苗根颈为外植体，培养于含有５ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ、０．２ｍｇ／ＬＫＴ和２００ｍｇ／ＬＬＨ的ＭＳ培养基上诱导愈伤组织，然后移至相同成份或不同浓度２，４－Ｄ的液体培养基中，进行悬浮培养，以建立分散性良好的悬浮细胞系。利用悬浮细胞和无菌苗叶片经酶解获大量原生质体，其产量分别约为每克鲜重２．５×１０５个和５×１０５个，活力均可达８０％。

【目的】探索鸡气管上皮细胞(chicken trachea epithelium,CTE)分离培养技术,并研究传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)在CTE中培养特性。【方法】利用气管灌注冷消化法分离培养CTE,对CTE特异性8/18角蛋白作免疫组化鉴定上皮细胞。培养的CTE分别接种IBVM41株和T株,分别在接种后第12～96小时观察接毒细胞形态学变化,应用电镜技术观察CTE细胞病变和病毒粒子结构,利用RT-PCR技术检测CTE中病毒核酸并对CTE中IBV的血凝性和鸡胚致病性进行检测。【结果】利用灌注冷消化法可以获得形态完整并带有纤毛的CTE,细...

对天津地区新发病害番茄红粉病的致病病原进行鉴定,并研究了不同培养基、温度和酸碱性对该菌生长速率和产孢量的影响,结果表明,造成天津地区番茄红粉病的致病病原为粉红单端孢(Trichothecium roseum (Bull.) Link);番茄红粉病菌菌丝伸长速度以在玉米粉琼脂培养基、V8蔬菜汁培养基、燕麦片培养基、马铃薯蔗糖培养基和黑麦培养基上最快;产孢量以玉米粉琼脂培养基和孟加拉红培养基最多;15~25℃为菌丝生长最适温度,产孢最适温度为20~30℃;粉红单端孢喜好中等偏酸性条件,但有较强耐受碱性环境能力,菌丝伸长和孢子着生以pH 5~9较为适宜。

比较了从不同来源的木麻黄根瘤中分离得到的三株弗兰克氏菌（Ｆｒａｎｋｉａ）在两种浓度不同碳源培养基中的生长差异，结果表明：供试菌株在以丙酮酸钠为唯一碳源时生长最好，其生长量为其它碳源的１．３～４７．７倍；最适合的碳源浓度为０．２３ｇＣ／Ｌ在三种不同的Ｆｒａｎｋｉａ菌培养方式中，通入无菌空气及发酵培养较静置培养能显著地提高弗兰克氏菌的生长量。同时还探讨了弗兰克氏菌的发酵条件。

从18日龄鸡胚长骨(股骨和胫骨)中机械分离破骨细胞于盖玻片和骨片上培养,以建立鸡胚破骨细胞体外培养方法。结合倒置相差显微镜、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、甲苯胺蓝染色及透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)对其形态和功能进行观察鉴定。结果表明,直接分离的细胞具有典型的破骨细胞的形态特点:属多核大细胞,TRAP染色阳性,能在骨片表面形成吸收陷窝。结论:鸡胚长骨机械分离法可获得一定数量并具有骨吸收活性的破骨细胞。

采用酶消化法和组织块法对小鼠、奶山羊、奶牛和家猪的表皮干细胞进行了分离、培养。结果表明:酶消化法适于小鼠表皮干细胞的分离,所获得的小鼠表皮干细胞在维持了两代之后自发分化为神经样细胞;奶山羊和奶牛不论用酶消化法还是组织块法都可以获得大量活力相对较好、表皮干细胞特性维持较久的细胞,奶山羊表皮细胞采用型胶原分选,用有血清培养液培养,经免疫细胞化学鉴定为表皮干细胞,可持续传至少9代,随着代数增高,细胞活力减弱。

【目的】研究和田羊睾丸支持细胞的体外培养特性。【方法】取新生和田羊睾丸组织,利用两步酶消化后,采用差速贴壁法纯化细胞进行体外培养,并通过形态学观察、HE染色、AKP染色、油红O染色、吖啶橙染色、罗丹明123染色、免疫组化染色、RTPCR和MTT法检测细胞活性及纯度。【结果】培养基中加入2.00%血清浓度的DMEM/F-12可提高支持细胞纯度,在体外培养传至20代的和田羊睾丸支持细胞形态和核型均为正常;所培养的细胞内波形蛋白表达及标志基因SCF和GDNF的表达均为阳性。【结论】本试验成功建立了和田羊睾丸支持

在体外分离培养奶牛瘤胃上皮细胞,可为奶牛瘤胃生理功能和吸收机制研究和永生化奶牛瘤胃上皮细胞奠定基础。通过胰蛋白酶消化法从奶牛瘤胃组织中分离出瘤胃上皮细胞,并通过免疫细胞化学的方法检测细胞角蛋白,CCK-8检测细胞生长曲线,β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞的衰老以及细胞染色体核型分析来鉴定瘤胃上皮细胞。结果表明:1)利用胰蛋白酶消化法可以稳定的培养出瘤胃上皮细胞并且能够在体外传代大约5代;2)通过在显微镜下进行细胞形态的观察呈单层"岛屿状";3)在荧光显微镜下细胞角蛋白抗原能够发出绿色荧光;4)奶牛瘤胃上皮细胞传