以野生大豆为材料,采用同源克隆方法和RT-PCR技术获得一个野生大豆糖原合成酶激酶类基因的全长cDNA(命名为GsGSK1)。该基因的ORF为1 233 bp,推断其编码410氨基酸的多肽。将此基因和与大豆糖原合成酶激酶基因的核苷酸序列比较发现二者有11个核苷酸SNP位点差异,其中,10个为同义突变,1个为非同义突变,同源性达到99.1%。通过构建重组植物表达载体pCAMBIA3300-GsGSK1,将该基因通过农杆菌介导法转入拟南芥,获得了T1抗性苗,为进一步鉴定GsGSK1的基因功能提供了试验基础。

采用RT-PCR法从水稻中成功克隆了1个水杨酸甲酯转移酶基因(OsSAMT1),构建了该基因的超表达载体,通过农杆菌介导法转化粳稻品种日本晴,获得10个转基因阳性植株.生物信息学分析结果表明,水稻基因组中共有12个OsSAMT1的同源基因,它们分别属于第6和第11号染色体上的2个基因族,而位于第2号染色体上的OsSAMT1基因与第6号染色体上的同源基因具有更高的相似性.

【目的】明确山西省野生大豆的遗传多样性程度及其数量性状多样性的地理分布,为山西省野生大豆种质资源的利用和保护提供依据。【方法】以山西省已编目入库的544份野生大豆为材料,对其质量性状、数量性状及SSR标记进行遗传多样性分析。【结果】研究的8个质量性状,山西省半野生大豆的遗传多样性高于野生大豆;太原材料的遗传多样性高于山西省材料。4个数量性状的研究结果显示,野生大豆的变异程度高于半野生大豆,山西材料的变异程度高于太原材料;初步推断37～38°N、112～113°E经纬小区为山西省野生大豆数量性状的多样性中心。利用30对SSR引物分析了49份山西太原野生大豆材料,共检测到208个等位变异,每个SS...

采用SSR标记鉴定野生大豆对10个大豆育成品种的遗传贡献.结果表明:野生大豆含有较多的特有等位变异,利用率为17.27%;回交能降低野生大豆特有等位变异利用率;野生大豆在16个位点上与粒重、荚粒数、高硬脂酸含量、抗胞囊线虫等有关的19个特有等位变异易被育成品种遗传利用;10个大豆育成品种在13个位点上产生了18个新的等位变异.利用野生大豆改良和创新大豆有较大空间.不同的杂交组合方式对育成品种的遗传贡献有明显差异.野生大豆的小粒、多荚、高硬脂酸含量以及抗胞囊线虫等优良性状基因易被育成品种选择利用.

【目的】克隆大豆查尔酮还原酶1(CHR1)基因,以构建的过表达载体pCAMBIA3301-CHR1转化大豆,获得含有CHR1基因的阳性植株,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】以大豆基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆CHR1基因,构建植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,对其进行PCR及双酶切鉴定。采用农杆菌介导法将该载体转入大豆"吉农28"中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,对CHR1基因mRNA相对表达量进行荧光定量PCR检测。【结果】克隆得到的CHR1基因大小为1 100bp。成功构建了植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,将其转化大豆后,通过P...

【目的】从分子标记等位变异水平上探讨中国野生大豆群体的遗传特征、连锁不平衡特点和地理生态分化的遗传机制,并以重要生态性状全生育期为代表解析性状地理分化的遗传基础。【方法】从全国24个省区不同地理生态型的野生大豆材料中抽选174份组成代表性样本,选用204个SSR标记,利用TASSEL及STRUCTURE 2.2软件进行群体连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD)和群体遗传结构分析。在此基础上对群体的地理分化、亚群体特异性及全生育期位点等位变异的地理分化进行遗传分析。【结果】中国野生大豆群体蕴含丰富的遗传变异,20条连锁群中,I和C2连锁群有相对较多的位点平均等位变异和遗...

采用ＲＴ–ＰＣＲ方法，成功克隆到１个与水稻苗期耐热相关的基因ＰＦＰ，构建了该基因的超表达载体，通过基因枪法转化水稻品种中花１７，获得９个转基因阳性植株，与对照相比，Ｔ１代转基因植株的苗期耐热性明显增强。３３个代表性地方水稻品种的耐热表型与ＰＦＰ基因型的相关性分析结果表明，ＰＦＰ基因的基因型与品种的耐热表型存在显著的相关性。本研究中还分析了该基因在盐、４℃低温、ＰＥＧ和ＡＢＡ胁迫处理下的基因表达情况。

克隆毛白杨纤维素合酶基因(PtoCesA1),全长为3215bp,与欧洲颤杨的PtrCesA1基因的同源性为97%,具有开放的阅读框,编码区在52~2988碱基之间,为2937bp。构建PtoCesA1基因的全长正义植物表达载体为pBIPA1,经酶切和PCR鉴定确认载体构建正确。通过农杆菌介导的方法将pBIPA1表达载体转入烟草中,转基因植株的纤维细胞壁厚度和木质部厚度都有不同程度的下降,形态表征为植株明显变矮,叶片变小。

为明确杜梨赤霉素受体GID1(Gibberellin insensitive dwarf 1)的生物学功能,以杜梨为试材,通过同源克隆方法得到PbGID1s基因,利用生物信息学分析软件构建基因结构并设计靶位点;利用酶切-连接方法将带有靶点的sgRNA表达盒构建至CRISPR/Cas9表达载体上;通过农杆菌介导方法,将CRISPR/Cas9表达载体转化至杜梨子叶中。结果表明,在杜梨基因组中克隆得到4个PbGID1s,分别命名为PbGID1b-1、PbGID1b-2、PbGID1c-1、PbGID1c-2,基因结构分析显示该家族基因均由2个外显子和1个内含子组成;氨基酸序列比对发现PbGID1s均具有GID1家族所特有的HGG和GXSXG保守结构域;将含有5个靶位点的sgRNA表达盒成功构建至pYLCRISPR/Cas9P_(35S)-N植物表达载体上,可同时对该家族4个基因进行编辑;杜梨遗传转化试验结果表明,共计浸染595粒杜梨子叶,获得抗性芽176个,阳性植株33株,转化效率达到5.55%。成功构建了可以同时靶向杜梨PbGID1s家族基因的CRISPR/Cas9载体,通过农杆菌介导,成功将该载体转化至杜梨子叶,并获得阳性植株,为杜梨遗传转化和基因编辑创建矮生突变体研究提供了重要参考。

利用滤纸吸附噬菌体-PCR法,从毛白杨花芽cDNA文库中分离克隆了PtPCP-like基因cDNA全长序列,测序表明克隆得到的该序列全长595bp,包含一个完整的开放阅读框,编码91个氨基酸;经BLAST分析发现,该基因包含与拟南芥花粉外被蛋白基因相似的序列,命名为PtPCP-like。采用RT-PCR技术检测PtPCP-like基因在各个组织部位的表达模式,结果显示在毛白杨的根和雄花芽中表达丰度最高,而在雌花芽部位表达丰度最低。并且构建35S∶∶PtPCP-like植物表达载体,采用农杆菌介导法将PtPCP-like基因导入烟草中,获得了一批阳性转化植株。采用qRT-PCR技术检测PtPCP...

为研究沙冬青脱水素的功能,根据沙冬青cDNA文库中脱水素基因序列设计特异引物,采用PCR技术扩增脱水素基因的DNA全长,并对其内部的一个碱基进行了定点突变,然后成功地将其连接到pCAMBIA3301载体中,用冻融法将该表达载体质粒导入根癌农杆菌菌株LBA4404中,通过农杆菌介导法,对糖用甜菜进行了遗传转化,获得了Km抗性的甜菜植株,生根后移栽到花盆中。

以大豆品种合丰25的球形期体细胞胚为受体,以CpTI基因为目的基因,应用基因枪法进行了遗传转化,同时以抗性体细胞胚筛选率作为转化率的指标,对影响基因枪转化的几个参数进行了优化研究。结果表明,氯化钙浓度2.5 mol/L、氦气压力1 100 Psi、轰击次数为2次,有利于提高转化率;经卡那霉素筛选得到抗性植株,经PCR分析鉴定有2株为阳性,初步证明外源基因CpTI已转到大豆基因组内。

[目的]本研究通过对大豆水通道蛋白基因GmTIP1-1的克隆及其在不同胁迫处理下的差异表达分析,探究水通道蛋白在大豆耐受非生物胁迫中的作用机制。[方法]从大豆品种‘天隆1号’中克隆出GmTIP1-1的CDS序列,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行分析。采用实时荧光定量PCR检测在不同逆境处理下GmTIP1-1在大豆根、茎、叶等组织的表达情况。利用基因枪轰击法对GmTIP1-1蛋白全长及不同跨膜结构域进行亚细胞定位分析。通过酵母双杂试验确定GmTIP1-1蛋白的互作蛋白,并利用实时荧光定量PCR检测在干旱处理下与GmTIP1-1互作蛋白基因的表达情况。[结果]GmTIP1-1的CDS序列全长为753 bp,编码250个氨基酸,等电点为6.51。系统进化分析发现,GmTIP1-1与苜蓿(Medicago truncatula)和黄瓜(Cucumis sativus)的亲缘关系十分相近。亚细胞定位结果显示,GmTIP1-1定位在细胞膜上。实时荧光定量PCR结果显示:GmTIP1-1在根中的表达量最高,在茎中次之,叶中最低;在干旱、ABA处理下均能诱导GmTIP1-1基因在大豆根、茎、叶中的表达;在干旱和ABA处理下,GmTIP1-1基因在根中的表达水平均高于在茎和叶中的表达水平。酵母双杂试验表明,GmTIP1-1与参与非生物胁迫调节的Gm SNARE蛋白以及响应逆境胁迫相关蛋白Gm F-box均存在互作。在干旱处理下,大豆根和茎中Gm SNARE和Gm F-box基因都会受到干旱诱导表达。[结论]GmTIP1-1蛋白定位于细胞膜,通过与参与非生物胁迫调节的Gm SNARE蛋白以及响应逆境胁迫相关蛋白Gm F-box互作来增强大豆对非生物胁迫的抗性。

【目的】DELLA蛋白属于GRAS家族,是赤霉素信号转导途径中重要的转录因子,负向调节GA转导途径。克隆获得紫花苜蓿GAI,分析其基因生物信息学特征并预测蛋白结构域。明确紫花苜蓿GAI组织表达特征及不同处理下的表达模式,构建该基因超表达载体并转入紫花苜蓿,以探究DELLA蛋白基因在紫花苜蓿赤霉素(GA)信号转导途径及胁迫条件下的作用机理。【方法】利用同源克隆的方法,从紫花苜蓿中克隆得到MsGAI。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用MEGA7.0对MsGAI蛋白序列及同源序列进行多序列比对,构建同源物种间的系统发育树。利用实时荧光定量PCR检测紫花苜蓿各组织GAI表达量以及在PEG、NaCl、GA、ABA和黑暗处理下,GAI的表达变化。同时对转基因GAI株系表达水平进行分析,选择表达量高、中、低株系(L5、L8、L11)分别进行PEG和NaCl处理,分析GAI的表达变化。以pBI121为基础载体,采用双酶切-连接的方法构建植物超表达载体35S:MsGAI-gus。将重组载体转入农杆菌GV3101菌株中,以紫花苜蓿叶片为外植体,采用农杆菌介导的愈伤组织转化法转化紫花苜蓿,经PCR检测和GUS组织化学染色,得到转基因阳性苗。【结果】该基因序列包含有一个1 818 bp的开放阅读框,编码605个氨基酸。生物信息学分析结果显示,MsGAI蛋白具有GRAS家族的典型结构域和保守区,其中包含N端保守结构域DELLA和TVHYNP,C端保守结构域SAW。多序列比对及系统进化树分析表明,该序列与其他物种的DELLA蛋白序列相似度均高达80%以上,将其命名为MsGAI。该基因与蒺藜苜蓿GAI亲缘关系最近,其次与鹰嘴豆、红三叶等双子叶豆科植物亲缘关系较近,与大麦等单子叶植物较远。实时荧光定量PCR分析表明,MsGAI在紫花苜蓿各组织中均有表达,根中的表达量最高。经PEG、NaCl、GA以及ABA处理后,均有明显响应;黑暗处理显著抑制MsGAI的表达。转基因株系经PEG、NaCl处理后,GAI表达量均上调。对构建完善的35S:MsGAI-gus植物超表达载体进行双酶切检测,琼脂糖凝胶电泳显示,条带大小与预期一致。对转基因植株进行GUS组织染色验证,结果表明,阳性植株呈现蓝色,对照组为白色。对超表达载体携带的MsGAI和GUS序列进行PCR检测均呈阳性。【结论】紫花苜蓿DELLA蛋白基因的克隆和超表达载体构建成功,MsGAI对逆境胁迫有响应。

FLK(Flowering Locus KH Domain)基因在植物开花调控过程中具有重要的作用，其功能在模式植物拟南芥中已经鉴定。为揭示大豆GmFLK基因功能，从大豆Williams 82中克隆获得GmFLK基因，并对其编码蛋白进行结构分析和生物信息学分析。在烟草叶片中检测该蛋白的亚细胞定位情况，在大豆中分析其表达模式。结果表明，GmFLK基因全长6 806 bp,含有6个外显子，5个内含子，CDS序列长1 341 bp,编码446个氨基酸。蛋白分子量大小为47.031 ku,等电点为5.46。GmFLK蛋白中α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲所占比例分别为24.44%,14.80%和60.76%。进化分析结果显示，GmFLK与Glyma.03g248200同源关系最近，其次为苜蓿Medtr7g115340、花生ArahyQL2VNI、ArahyUPVY9X和拟南芥AtFLK。亚细胞定位结果表明，GmFLK蛋白在细胞核、细胞质和细胞膜中均有表达。GmFLK基因启动子区域含有10类顺式作用元件，其中6类与光反应有关。GmFLK基因在花、叶、根、种子和茎中均有表达，其中在叶和种子中表达相对较高，在花中表达相对较低。GmFLK基因在长日照和短日照条件下表达模式相似，但在一天中不同时间点表达不同，在光照后4 h表达相对较低，在光照后0,12 h表达相对较高，由此推测，大豆GmFLK基因可能参与大豆开花调控途径。