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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
姚仕义 王金生
用ｐＩＪ３２００作为载体，构建了包含１５６２个重组克隆野生型野油菜黄单胞菌的粘粒文库，通过三亲交配法，基因文库中的重组克隆可以在ｐＲＫ２０１３的帮助下，从Ｅ．ｃｏｌｉ中转移到ＸＣＣＮＡＵ－９２中，绝大多数重组克隆对黄原胶合成无影响，但导致菌株生长缓慢。工程菌株ＸＣＣＮＡＵ－９２７８（ｐＩＸＵ９２７８）在２８℃、１２０ｒ／ｍｉｎ条件下发酵７２ｈ，产量达３７．５０ｇ／ｋｇ，发酵液粘度为１４６００ｍＰａ·ｓ，与ＸＣＣＮＡＵ－９２相比，产量增加７．１４％，发酵液粘度增加７．３５％。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
陈红歌 陈健 王旭 胡渝 马向东
对野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶进行了定位,确定该酶为胞外酶,且只有一型α-淀粉酶。采用切胶纯化得到纯酶,SDS-PAGE测得其相对分子质量为52ku。研究显示,该酶的最适作用温度为50℃,最适pH值为6.2,通过酶的稳定性研究发现该酶热稳定性较差,而pH值在4.86～10.47具有较好的稳定性。
关键词：
野油菜黄单胞菌 α-淀粉酶 酶学性质
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
刘忠松 孙东红 刘显军 官春云
原花色素是类黄酮生物合成途径的终端产物,其基因调控网络在拟南芥、葡萄等基因组已经测序的植物中得到充分阐释。种皮中原花色素的积累与种子颜色、种子休眠和寿命有关。油菜种皮中原花色素的积累决定种皮颜色,同时影响种子的油分含量。本文综述了通过图位克隆、同源克隆和电子克隆等途径克隆油菜原花色素合成途径基因的进展,分析了在油菜中已经克隆的部分原花色素合成途径基因与种皮颜色的关系,提出了如何利用已经公开的油菜、白菜基因组序列通过筛选BAC文库得到基因不同拷贝的全长序列的综合路径,列举了笔者运用该方法已经克隆的部分原花色素合成途径基因拷贝数,以期揭示油菜原花色素形成积累的基因调控网络。
关键词：
油菜 原花色素合成 基因克隆
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张立强 谢海侠 李楠 聂品
利用PCR方法从柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)G4株中克隆了1个胶原蛋白酶基因(GenBank登录号EF501979)。同源性比对发现该基因与柱状黄杆菌的另外1种胶原酶基因(GenBank登录号EAZ95511.1)最为相近,有84%的一致性和93%的相似性。该属的另外2种细菌,约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)和嗜冷黄杆菌(F.psychrophilum)都有与该胶原酶基因相似的基因,其相似性分别为92%和83%。该基因经KpnI和SalI酶切后连接到表达载体pET-32a上,转入大肠杆菌BL21(DE3)plysS内进行表达,经...
关键词：
柱状黄杆菌 胶原蛋白酶 克隆 表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孔祎頔 田佳鑫 赵林辉 陈秀梅 单晓枫 王桂芹
【目的】克隆维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)低钙反应蛋白(AcrV)并进行原核表达,为进一步研究AcrV蛋白的结构功能及AcrV基因工程亚单位疫苗的制备奠定基础。【方法】克隆维氏气单胞菌TH0426菌株AcrV基因,通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级结构及三级结构。将AcrV基因克隆到pET-30a(+)原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,进行EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切鉴定和测序鉴定。用IPTG对pET-30a(+)-AcrV进行诱导表达,对IPTG浓度(0.2,0.4,0.6和0.8 mmol/L)和诱导时间(2,3,4和5 h)进行优化。在最佳条件下诱导表达重组蛋白AcrV,经镍柱纯化且尿素梯度复性后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,进行SDS-PAGE及Western blot分析,对目的蛋白的免疫原性进行检测。【结果】成功获得了1 086 bp的AcrV全基因,编码361个氨基酸。AcrV蛋白是无跨膜结构且不编码信号肽的蛋白,有2个高度保守的结构功能域,属于全α型蛋白。成功构建了原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,其最佳诱导表达条件为IPTG 0.8 mmol/L诱导5 h。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,AcrV蛋白能被鼠抗阳性血清识别,表明其具有一定的反应原性。【结论】成功克隆了1 086 bp的AcrV基因,分析了其编码蛋白的生物信息;获得了免疫原性良好的重组AcrV蛋白。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李欣 庞新跃 朱文学 李鑫玲 刘严 郭菡 李红玉 赵春燕
【目的】探讨互作体系中病原菌来源过氧化氢的作用。【方法】采用组织化学法通过透射电子显微镜技术观察水稻与油菜黄单胞菌菜豆致病变种互作体系中的过氧化氢积累的定位。【结果】突变体菌株细胞中烷基过氧化物还原酶亚基C的缺失导致胞内其余过氧化氢清除酶活性的补偿性显著上升,使胞内内源过氧化氢积累水平显著下降,并引起病原菌与水稻互作体系中的过氧化氢积累水平发生显著变化。【结论】病原细菌很可能是互作体系中过氧化氢的一个重要来源。病原细菌产生的过氧化氢很可能在非寄主互作中造成细菌周围植物细胞的损伤,对植物细胞具有潜在的毒性。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘晗 刘鹏 崔铁军 白雪芳 杜昱光
对从野外土壤中分离得到的1株可降解黄原胶的兼性厌氧菌进行了鉴定。结果表明,该菌株在幼龄时期为杆菌,大小约为(0.4~0.6)μm×(1.0~2.0)μm,呈直杆形或稍弯曲杆形,但在1周以上的培养物中,只存在大小约为0.5μm×0.5μm的类球状细胞;该菌为革兰氏阴性,兼性厌氧,无运动性,不形成芽孢,能利用多种糖类基质。初步鉴定该菌为鞘氨醇单胞菌(Sph ing om onas)。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
严明理 刘忠松 官春云 陈社员 刘显军 袁谋志
【目的】分离和克隆芥菜型油菜类黄酮合成相关基因。【方法】采用同源克隆基因的方法,参照拟南芥等植物控制类黄酮合成的基因保守序列设计引物,对扩增片段进行测序并进行BLAST分析。【结果】有13对引物扩增的17个基因拷贝与参考基因序列相符,这些克隆属于13个已知功能基因,其中查尔酮合成酶基因有3个不同的基因拷贝,花色素形成(Production of anthocyanin pigment)基因和查尔酮异构酶基因分别有2个不同的基因拷贝,其余引物的扩增只获得一个拷贝。在GenBank数据库中进行检索表明,所克隆的基因拷贝中的DNA结合/转录因子基因(TT2、TT8、TTG2)、花色素形成基因(PAP...
关键词：
芥菜型油菜 类黄酮 基因
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
杜娜 顾泽茂 袁军法 林蠡 翟艳花 刘学芹 罗宇良
根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)气溶素(aerolysin,Aer)基因的序列设计引物,以来自湖北的鱼源A.hydrophila分离株为模板扩增出aer基因的ORF序列,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定。测序结果表明,A.hydrophila的aer基因的系统进化树中国内菌株聚为一支,国外菌株聚为一支。通过pET-32a(+)载体构建Ah15株aer基因的表达载体pET32a-15,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约72.2ku相吻合的融合蛋白带,且以包涵体形式存在。浓缩后的...
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
刘增才 唐玉倩 佟鑫宇 邹莉
【目的】对参与暴马桑黄赤霉素合成途径关键酶-牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPS）基因进行克隆及诱导表达研究，以期深入了解暴马桑黄的生长发育机制，为获得优质高产的暴马桑黄菌株提供理论依据。【方法】采用PCR扩增技术获得暴马桑黄GGPS基因cDNA全长及启动子序列，利用生物信息学软件对序列进行分析；qRT-PCR技术分析不同浓度茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）对暴马桑黄GGPS基因转录水平的影响，并用分光光度计测定不同浓度MeJA诱导下赤霉素含量的变化；电子天平称量暴马桑黄菌丝体生物量；SDS-PAGE检测暴马桑黄GGPS基因原核表达情况。【结果】将克隆得到的暴马桑黄GGPS启动子和基因分别命名为SbGGPS启动子和SbGGPS基因。SbGGPS启动子分析结果显示，除了含有CAAT-box、TATA-box典型的启动子作用元件之外，还含有MeJA响应元件。基因分析发现，SbGGPS基因cDNA序列全长945 bp，共编码314个氨基酸，蛋白相对分子量35.89 k Da，不存在信号肽和跨膜结构。荧光定量分析、赤霉素含量测定及生物量检测结果表明，SbGGPS基因转录水平、赤霉素含量及生物量均随着MeJA浓度增加呈现显著下降的趋势，三者变化趋势基本一致，并且两两之间均呈显著正相关。SDS-PAGE结果显示，SbGGPS基因能够在原核系统中成功表达出蛋白。【结论】通过对SbGGPS基因的克隆及诱导表达分析发现，该基因在暴马桑黄赤霉素生物合成及生长发育过程中具有重要作用。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李平 龙菊英 张燕 高学文 王金生
水稻黄单胞细菌白叶枯致病变种与水稻品种的互作关系符合基因 基因假说。病菌无毒基因 (A)与寄主抗病基因(R)显性互作表现抗性反应。许多黄单胞细菌的无毒基因属于avrBs3/ pth家族。已报道的avrxa5、avrXa7、avrXa10以及本实验室从水稻白叶枯病菌菌株JXOⅢ克隆的avrXa3均属于avrBs3/ pth家族。最近的研究还发现 ,PR6菌株中有2个硫同化基因簇成员raxP和raxQ对决定avrXa2 1活性是必需的。笔者在研究无毒基因avrXa3时 ,从JXOⅢ的基因组文库克隆中发现一个与甘蓝黑腐黄单胞菌烯醇化酶 磷酸酶基因的同源序列也具有无毒基因活性。在介绍黄单胞细菌无毒...
[期刊] 林业科学研究
[作者]
李泽华 杜娟 贺学娇 赵树堂 刘颖丽 卢孟柱
[目的]DET2基因编码一个5α-还原酶,是油菜素内酯(BRs)合成过程中的关键限速基因。研究DET2基因在杨树生长发育中的作用,对于进一步研究油菜素内酯在木本植物中的调控机制有重要意义。[方法]从银腺杨84K(Populus alba×P. glandulosa,‘84K’)克隆得到拟南芥AtDET2同源基因PagDET2,利用生物信息学对其进行序列比对、生化特征分析、构建系统发育进化树。通过RT-PCR分析其在杨树中的表达模式。构建由CaMV 35S强启动子驱动的过表达载体,通过农杆菌介导的叶盘转化法转化84K杨,得到PagDET2-OE转基因植株。分析过表达DET2基因对于转基因植株内源BRs含量、植株生长和抗逆的影响。[结果]克隆了包含全长编码区PagDET2基因全长,可编码一个长度为257个氨基酸的蛋白质。其蛋白序列与毛果杨、拟南芥、水稻、棉花、大豆、番茄DET2蛋白同源性较高,说明该基因在进化过程中相对保守。PagDET2在84K杨不同组织中均检测到表达,其在茎中的表达较高。通过ELISA检测植物BRs含量发现,过量表达DET2可以显著提高杨树内源BRs含量。过量表达DET2基因,可以导致转基因植株的高生长,但对盐胁迫更加敏感。[结论]DET2基因作为BRs合成的关键基因,在杨树中过量表达可以显著提高内源BRs含量,促进植株增高。DET2转基因植株的获得为进一步分析BR参与木本植物生长发育的调控机制奠定了基础。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
喻红稠 覃悦 韩长志
具有脂蛋白信号肽的蛋白参与细胞膜结构构建、细胞膜稳定性维护、信号转导和转运等过程，在维持细菌生理功能、致病性和耐药性等方面发挥重要作用.树生黄单胞杆菌是杧果生产中的重要病原之一，目前尚缺乏有关该菌脂蛋白信号肽蛋白的研究.本研究基于树生黄单胞杆菌的全基因组序列，通过LipoP v1.0在线程序分析，获取了175条具有脂蛋白信号肽的蛋白序列，并对这些蛋白开展了包括保守结构域、信号肽、跨膜区结构域、亚细胞定位和理化性质等的生物信息学分析.结果表明：144个脂蛋白氨基酸序列长度集中于100～500个之间；163条蛋白序列具有信号肽，仅有13条蛋白序列具有明显的保守结构域；90个蛋白定位在线粒体；这些蛋白在亲(疏)水性最强氨基酸残基及其位置方面存在较大的差异.此外，通过遗传关系分析进一步明确了与树生黄单胞杆菌中脂蛋白信号肽蛋白具有较高同源性和较近亲缘关系的其他物种，而大部分脂蛋白信号肽间的同源性并不高.
[期刊] 水产学报
[作者]
叶汉梅 魏晓雷 谭肖英
细胞因子信号传导抑制因子(suppressor of cytokine signaling, SOCS)是一类由细胞产生的胞内蛋白,能够反馈性阻断细胞因子信号传导过程的负性调控因子。为深入研究黄颡鱼细胞因子信号传导的发生过程和机制,实验从黄颡鱼cDNA中克隆获得561 bp的黄颡鱼SOCS1(PfSOCS1)基因编码序列,成功构建了重组质粒pET32a(+)-PfSOCS1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等条件下进行表达,确定最佳表达条件。本实验采用包涵体纯化的方法得到纯度较高的重组SOCS1蛋白;以重组PfSOCS1蛋白免疫Balb/C小鼠,制备多克隆抗体。通过Western blot鉴定了PfSOCS1抗血清可以特异性识别重组PfSOCS1蛋白。蛋白水平的组织分布显示,黄颡鱼SOCS1蛋白在肝脏中表达水平较高。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵静 孙洋 谭永安 肖留斌 姜义平 柏立新
【目的】制备甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)多克隆抗体,并检测甜菜夜蛾不同发育时期血淋巴中的Vg蛋白表达量变化,为进一步研究Vg转运与利用机制以及生物学功能打下基础。【方法】以羽化24 h的甜菜夜蛾雌成虫c DNA为模板,通过PCR扩增得到甜菜夜蛾Vg基因片段,其包含vitellogenin-N结构功能区。将Vg目的片段连入pMD-19T载体后进行测序,利用DNAMAN软件分析该基因序列的准确性及编码蛋白的特性。将测序正确的Vg基因片段通过Nde
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