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[期刊] 华北农学报
[作者]
李楠楠 左玉玲 隋炯明 盖树鹏 樊连梅 李广存 郭宝太
先经过饱和硫酸铵沉淀分离,再用Protein G亲和层析柱纯化,从马铃薯卷叶病毒(PLRV)重组CP作抗原制备的抗血清中获得了高纯度多克隆抗体(IgG),并用戊二醛法一步法进行碱性磷酸酶的标记获得了酶标抗体(IgG-AP)。将纯化的抗体与酶标抗体用于感染PLRV病叶的检测,DAS-ELISA反应呈阳性,结果表明,用重组CP制备的多克隆抗体可成功地用于PLRV的DAS-ELISA检测。本研究为PLRV重组CP多克隆抗体的大量制备及ELISA检测奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
宋志成 费新敏 杨煜 乔利仙 王晶珊 李广存 郭宝太
利用重组CP作抗原制备出马铃薯A病毒的多克隆抗体,并将其用于DAS-ELISA检测。以p ET22b(+)为起始载体,构建了PVA-CP基因的原核表达载体p ET22b-ACP,重组菌BL21(p ET22b-ACP)经IPTG诱导表达出了分子量为30 k Da的特异性重组CP。利用高纯度重组CP为抗原免疫家兔,制备出了效价为1∶512 k的抗血清。以PVA重组CP为抗原,用间接ELISA与直接ELISA分别测定重组CP纯化抗体(Ig G)及其碱性磷酸酶标记物(Ig G-AP)的活性,用DAS-ELISA
[期刊] 华北农学报
[作者]
吉祥 宋志成 韦晓玲 杨煜 隋炯明 郭宝太
为了制备出马铃薯卷叶病毒(PLRV)与S病毒(PVS)重组双CP多克隆抗体并用于PLRV与PVS这2种病毒的间接与DAS-ELISA检测，构建了PLRV与PVS融合双CP基因的原核表达载体pET22b-LRCP/SCP,用超声破碎法代替溶菌酶法裂解重组菌BL21(pET22b-LRCP/SCP)并提取菌体蛋白，用镍离子亲和层析纯化获得了分子质量为51.2 ku的高纯度的重组双CP。用该重组双CP作抗原免疫家兔获得了高效价(1∶128 k)抗血清。纯化的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性标准物特异性结合，与另外4种马铃薯主要病毒(PVX、PVY、PVA与PVM)无交叉反应。间接ELISA反应中，稀释度为1∶3 200的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性物都呈现阳性反应；在DAS-ELISA反应中，稀释度均为1∶100的重组双CP多克隆抗体及其碱性磷酸酶标记物与PLRV或PVS的阳性标准物也分别呈现阳性反应。结果表明，制备的重组双CP抗体既可用于PLRV与PVS这2种病毒的间接ELISA检测，也可用于DAS-ELISA检测。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
邱又彬 陶刚 黄永会 李奇科 刘作易 朱英 郑世玲
利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)技术从马铃薯病毒发病叶片中检测并克隆到PVX、PVY和PLRV3种病毒及其外壳蛋白基因的全长序列,长度分别为714、804和627 bp。结果表明,TC-RT-PCR技术是一种简单,快捷,灵敏度高的方法,在马铃薯病毒的检测和相关基因的克隆中将会得到很好的应用。
[期刊] 华北农学报
[作者]
胡世享 叶玲玲 肖妍 卓娜 王滕芬 汪琳 蒲静 陈培富 艾军
为建立一种用于快速检测赤羽病病毒抗体的竞争ELISA法。用AKV病毒免疫Balb/C小鼠，将其脾细胞与SP2/0细胞进行免疫融合，以获得抗AKV的单克隆抗体；利用Bac-to-Bac杆状病毒表达的SBV N蛋白作为诊断特异性抗原，山羊抗鼠HRP-IgG为二抗，建立并优化AKV抗体检测的竞争ELISA方法。得到一株持续稳定繁殖的能够分泌单抗AKV核蛋白抗体的杂交瘤细胞株，单抗亚型鉴定为：重链IgG1,轻链kappa,仅能与AKV病毒呈阳性反应，与BTV、FAMD、EHDV病毒等病毒抗原不发生特异性反应；建立的检测AKV抗体ELISA检测方法，诊断抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,1∶1 000抗体稀释比，1∶50血清稀释比，1∶2 000二抗稀释比，封闭条件为5%BSA,37℃封闭2 h,确定了血清抑制率大于等于44%时为阳性，小于44%为阴性；所建立的ELISA方法敏感性和特异性鉴定结果与ID Screen AKV Competition检测试剂盒一致。本试验成功制备出一株分泌针对AKV N蛋白的杂交瘤细胞系，建立的ELISA检测方法能够用于检测动物AKV抗体，为进一步开展AKV抗体诊断试剂工艺研究、产业化奠定了基础。
关键词：
赤羽病 单克隆抗体 竞争ELISA
[期刊] 西南农业学报
[作者]
梁学超 向本春 程朝玲 苏海娣 郑银英
本文通过一步法RT-PCR技术,检测新疆加工番茄马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)感染率。结果表明,新疆加工番茄马铃薯Y病毒感染率为25%。选取10个样品利用RT-PCR技术,克隆CP基因,获得807 bp全长CP基因,编码268个氨基酸。CP基因序列比对分析与系统进化树分析表明,侵染新疆加工番茄的马铃薯Y病毒属于PVYN:O株系。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
高芳銮 沈建国 史凤阳 方治国 谢联辉 詹家绥
【目的】查明马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)病在中国的发生情况,及时、准确地鉴定出PVY并对其分子变异进行分析。【方法】采用ELISA方法对采自中国14个省(直辖市)马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行了检测,并对其中的部分材料镜检验证,然后根据CP基因序列设计1对简并引物针对随机选择感染PVY的14个省(直辖市)代表样品进行CP基因扩增克隆,将测序得到的序列进行分子变异分析,并使用贝叶斯法(Bayesian inference,BI)重建系统发育关系。【结果】ELISA检测结果表明,691份样品中220个样品与PVY抗体呈阳性反应,其余呈阴性反应;ELISA检测的阳性材...
[期刊] 水产学报
[作者]
冯军厂 常绪路 朱振祥 郭祥瑞 赵燕静 刘慧芬 张建新 聂国兴
为从蛋白质水平研究细胞因子在鲤体内免疫应答过程中的合成变化,本研究采用PCR技术克隆TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β基因含有部分抗原决定簇的片段,引入双酶切位点Bam HⅠ和HindⅢ后连接至p ET-32a/21a,构建相应的表达载体,制备多克隆抗体。采用ELISA检测抗体效价,并以此作为实验工具,检测经嗜水气单胞菌感染后鲤血清中炎性细胞因子的合成变化。结果显示,基因TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β融合蛋白分子量分别约为31.8、31.7、35.3、32.5、18.0和33.6 ku;抗体效价达到2.4×106;在病原菌感染后的不同阶段,促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和抗炎细胞因子IL-10、TGF-β呈现出不同的合成变化。研究表明,制备的抗体具有较高的效价、亲和力和特异性,可用于鲤细胞因子的定量研究,该抗体的获得为鲤免疫应答与细胞因子合成的系统研究奠定了基础。同时,获取的鲤细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β的抗体亦可用于其他鱼类细胞因子蛋白质水平的定量研究。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李盼 支瑶 汪方奎 陈雯莉
CcmK2蛋白是集胞蓝细菌PCC 6803羧酶体外壳蛋白的主要组分,在羧酶体的组装与功能行使方面扮演重要角色。为解析其功能,本研究构建了原核表达载体pET28a-CcmK2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达带有6个组氨酸标签的CcmK2重组蛋白。通过金属亲和层析技术,将CcmK2重组蛋白纯化后免疫家兔,制备抗CcmK2多克隆抗体。基于Dot blot分析的结果显示:该多克隆抗体能够有效检测蓝细菌CcmK2蛋白;进一步的抗体特异性分析显示,CcmK2多克隆抗体与其他羧酶体外壳蛋白存在微弱的抗原抗体反
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
苏小东 曹瑞兵 张羽 刘文娟 陈昊 祝长青 陈溥言
鸭圆环病毒(DuCV)是新发现的一种感染鸭的最小病毒,可导致鸭淋巴组织损伤。目前尚无检测其抗体的商品化ELISA试剂盒。为了对鸭群进行DuCV血清流行病学调查,本试验用原核表达了全长DuCV Cap蛋白,Western blot检测证明表达产物具有良好的抗原性。以纯化的重组Cap蛋白作为包被抗原,应用30份DuCV抗体阴性血清和16份DuCV抗体阳性血清,建立了检测DuCV抗体的间接ELISA方法,以此方法对从江苏地区收集的部分鸭血清样品进行检测,结果显示DuCV抗体阳性率为26.7%(38/142)。试验证明该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,且方法的变异系数均小于10%。结论:该方法操...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
程国富 胡薛英 周诗其 熊道焕
本实验运用单克隆抗体ＰＡＰ法，对实验感染鸭肝炎病毒雏鸭的组织切片进行染色观察，旨在动态研究病毒在雏鸭体内的分布以及病毒与组织病变的关系。研究结果显示，感染后３ｈ，雏鸭心肌、肝、脾、肾、胰、腿部肌肉、大脑等组织的细胞浆内均出现了ＰＡＰ染色的特异性棕黄色产物，除胰脏组织切片的ＰＡＰ反应性在感染后１６８ｈ达到最高外，上述其他组织的最高ＰＡＰ反应性均在感染后２４ｈ；对同期的不同组织切片比较观察发现，肝、脾、胰外分泌腺、肾小管上皮细胞及腿部肌肉细胞的ＰＡＰ反应性比心肌及大脑神经元细胞的ＰＡＰ反应性强。由此表明，鸭肝炎病毒在感染后３ｈ达全身化，并主要侵害肝、脾、肾、胰及腿部肌肉，继而引起相应的变化
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
孙智锋 杜念兴 徐为燕
将抗兔出血症病毒(RHDV)的 AA8-1和 CG4-1两株单抗(McAb)分别致敏双醛化人红细胞,混合后建立单抗反向间接血凝(McAb-RPHA)方法。其敏感性较常规血凝试验(HA)高256倍,最小检出量为0.214 ng/ml。此法对感染兔的心、肝、脾、肺、骨髓、血液等检出率均为100%;脊髓、淋巴结、肌肉等组织的检出率分别为62.5%,58.3%和37.5%。HA 的检出率除肝为100%外,其余均低于 McAb—RPHA,不能检出脊髓、淋巴结和肌肉样品中的病毒抗原。
[期刊] 华北农学报
[作者]
郭志华 孙毅 张效梅 张健 白云凤
根据Genbank已报道马铃薯卷叶病毒(PLRV)基因组序列,分析其基因间隔区(IS)两端的保守区,自行设计、合成一对特异性引物,以PLRV内蒙古分离物总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到含PLRVIS的一段369 bp的cDNA,克隆于载体pBS-T中。重组质粒经PCR鉴定、酶切分析和核苷酸序列测定,并进一步与PLRV其他分离物的同源序列作比对。结果表明:克隆的PLRV内蒙古分离物的IS序列与其他全部已发表的13个全基因组中的IS核苷酸序列有很高的同源性,最高达到100%,平均为97.90%,高于这13个PLRV全基因组序列96.81%的同源性,说明IS序列不仅在PLRV的不同株系间比较保...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
秦春香 谢芝勋 谢丽基 刘加波 庞耀珊 邓显文 谢志勤
将纯化好的两个ARV结构蛋白σ3和σ2作为包被用抗原,分别进行间接ELISA,并确定它们的最佳抗原包被浓度分别为9.5、12.0μg/mL;一抗血清的稀释度为1∶200;HRP酶标羊抗鸡IgG稀释度为1∶5000,初步建立了能检测ARV抗体的σ3-ELISA、σ2-ELISA以及σ3、σ2两个蛋白同时包被的σ3-σ2-ELISA检测方法。分别用上述3种方法对制备的ARV SPF鸡阳性血清进行检测,结果阳性检出率分别为90.91%、69.70%和100%。表明σ3-σ2-ELISA方法在ARV抗体检测方面具有较高的敏感性。
关键词：
禽呼肠孤病毒 结构蛋白 间接ELISA
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王玉燕 华修德 钱国良 李刚 刘凤权
为建立噻菌灵酶免疫检测方法,制备3种噻菌灵的半抗原(H1、H2和H3)。利用活泼酯法制备免疫抗原H1-BSA、H3-BSA和包被抗原H1-OVA、H2-OVA、H3-OVA。采用杂交瘤细胞融合方法获得4株稳定分泌抗噻菌灵单克隆抗体的细胞株,分别命名为1-4G9、1-6D3、3-1F9和3-5D4。采用间接竞争酶联免疫法(IC-ELISA),将上述4株抗体分别与3种包被抗原进行组合,从中选择出一个最优组合:H3-OVA/1-6D3。据此建立的异源IC-ELISA检测方法对噻菌灵的IC50为10.9μg.L-1,检测限(IC10)为2.2μg.L-1,与3种噻菌灵类似物的交叉反应率均小于0.1%;...
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