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[期刊] 水产学报
[作者]
曹永生 徐黎明 赵景壮 刘淼 张奇亚 卢彤岩
为获得虹鳟ＩＦＮ－γ２（ｒｔ ＩＦＮ－γ２）抗传染性造血器官坏死病毒（ＩＨＮＶ）活性的相关数据，实验根据ＮＣＢＩ已发表序列设计引物，提取经植物血凝素刺激后的虹鳟头肾细胞总ｒＮＡ，采用ｒｔ－ＰＣｒ方法扩增４７１ ＢＰ的该基因完整开放阅读框。将该基因重组至原核表达载体Ｐ Ｅｔ３２Ａ中，并转化大肠杆菌ｒｏｓＥｔｔＡ，进行诱导表达，ｓＤｓ－ＰＡＧＥ结果显示，目的蛋白以包涵体形式表达，大小约为３８．４ ｋｕ。重组蛋白经复性、纯化后在ＣＨｓＥ－２１４细胞上进行抗ＩＨＮＶ活性分析，结果显示，ｒｔ ＩＦＮ－γ２在ＣＨｓＥ－２１４细胞上抗ＩＨＮＶ活性为６．６３×１０６ｕ／ｍＧ。ｒＥＡｌ－ｔＩｍＥ ＰＣｒ结果显示．．．
[期刊] 海洋渔业
[作者]
李想 黄文树 黄贝 徐继松 翟少伟 梁英 张婉婷 刘海姿
分别以日本鳗鲡(Anguilla japonica)pMD19-T-IFNγ和pMD19-T-IFN-γrel重组克隆质粒为模板,采用PCR方法扩增日本鳗鲡IFN-γ和IFN-γrel基因,而后分别将IFN-γ和IFN-γrel成熟肽的编码序列克隆至原核表达载体pQE30和pET32a上,成功构建了重组表达载体pQE30-IFN-γ和pET32a-IFN-γrel。将重组表达载体pQE30-IFN-γ和pET32a-IFN-γrel分别转化入Escherichia coli M15和Escherichia coli BL21感受态细胞进行表达,并优化IPTG诱导表达体系后用SDS-PAGE电泳鉴定IFN-γ与IFN-γrel重组蛋白表达形式。IFN-γ与IFN-γrel重组蛋白经镍柱纯化后进行SDS-PAGE电泳检测和Western blot鉴定。结果显示,重组表达载体pQE30-IFN-γ与pET32a-IFN-γrel分别在E.coli M15和E.coli BL21中得以正确表达。重组IFN-γ蛋白分子量为21 kD左右,表达的融合蛋白以可溶性形式存在;重组IFN-γrel蛋白分子量为31 kD左右,以包涵体形式存在。且两者均在1.0 mmol·L~(-1) IPTG诱导6 h时表达量最高。经镍柱纯化和Western blot检测,成功获得高纯度的IFN-γ和IFN-γrel重组蛋白。建立了日本鳗鲡IFN-γ和IFN-γrel基因的原核表达系统,为进一步研究日本鳗鲡干扰素系统的功能及调控机制奠定了基础。
关键词：
日本鳗鲡 Ⅱ型干扰素 原核表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
贾成霞 张照斌 张清靖 刘盼 朱华
克隆了虹鳟(Oncorhynchus mykiss)过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)αmRNA全序列。对其序列分析发现,虹鳟PPARα与其他脊椎动物PPARα有较高的同源性,其中mRNA序列有66.4%~97.5%相同,氨基酸序列有69.2%~98.9%相同。DNA结合结构域和配体结合结构域从鱼类到人类高度保守,其中DNA结合结构域有88.0%~98.8%的氨基酸序列相同;配体结合结构域有74.6%~99.6%的氨基酸序列相同。系统发生树分析表明,虹鳟的PPARα基因与同属鲑科鱼类的大西洋鲑(Salmo...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
周启苓 马骞 毛非凡 杨二军 王刘永 陈刚
合理选择盐度驯化方式是目前虹鳟(Oncorhynchus mykiss)养殖生产所要解决的重要问题之一。本研究通过分析盐度驯化对虹鳟幼鱼外骨骼(鳞组织)中基因表达水平的影响，重点探讨盐度对鱼类骨代谢的影响机制。首先，分别采集盐度28海水驯化7 d和常规淡水养殖(对照)条件下的虹鳟鳞组织，采用Illumina HiSeq 4000测序平台进行转录组测序(RNA-Seq)。通过设置显著差异表达基因(DEGs)筛选条件为log_(2)|fold change|≥1且P
[期刊] 水产学报
[作者]
赵景壮 徐黎明 刘淼 曹永生 尹家胜 刘红柏 卢彤岩
为了能够成功表达虹鳟IgM,本研究利用生物信息学软件对虹鳟IgM的亲水性及抗原性进行了分析,根据GenBank收录的虹鳟IgM重链恒定区,参照生物信息学分析结果,设计用于扩增截短的IgM基因的引物,以虹鳟头肾RNA提取物为模板,利用RT-PCR方法扩增虹鳟截短的IgM重链恒定区部分基因片段,连接原核表达载体pET-27b,利用大肠杆菌Rosetta进行表达。SDS-PAGE及HPLC结果显示,纯化后截短的IgM大小约为47.7 ku,且纯度达到90%。利用其制备兔抗血清后ELISA分析结果显示,所制备的兔抗血清与本研究所表达的截短IgM蛋白的反应效价为1∶40 000,与虹鳟血清提取的全长Ig...
关键词：
虹鳟 IgM 基因克隆 抗血清
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
黄进强 王晓谰 李永娟 吴深基 赵璐
前黑素小体蛋白a (premelanosome protein， pmela)基因是黑色素合成通路中的关键基因之一，对动物的体色有着重要影响。为探讨pmela基因在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)体色变异中的作用，本研究利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends， RACE)技术对pmela基因cDNA全长进行克隆并运用生物信息学方法分析该基因的序列特征，同时采用qRT-PCR比较pmela在野生型虹鳟(虹鳟)、黄色突变型虹鳟(金鳟)和杂交F_(1)代受精期至孵化后3个月不同发育时期及成鱼不同组织中的相对表达量。研究获得pmela基因cDNA全长序列3476 bp，包含2532 bp开放阅读框，编码843个氨基酸。序列分析发现，Pmela为疏水性蛋白且存在PKD功能结构域。同源性比对发现，虹鳟Pemla氨基酸序列与红鲑(Oncorhynchus nerka)的同源性高达97.75%；进化分析结果显示，虹鳟与红鲑的亲缘关系最近，与人类(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的亲缘关系最远。qRT-PCR结果显示，pmela基因在虹鳟与金鳟胚胎及出膜后各时期均有表达，在受精期至16细胞期中的表达为虹鳟高于金鳟，出膜后该基因在金鳟背部皮肤中的表达均高于虹鳟，且在4细胞期、16细胞期、原肠期、神经期、体节期、心跳期、1 day post-hatching (1 dph)、3 dph、5 dph、7 dph、10 dph、1 month post-hatching (1 M)和2 M时期中，虹鳟与金鳟的表达存在显著差异。在各组织中，pmela基因在虹鳟与金鳟背部皮肤和眼睛中的表达显著高于其他组织。在杂交F_(1)代中，pmela基因在不同发育时期和组织中的表达模式与双亲类似，且在大部分相同时期和组织中的表达与双亲存在显著差异。上述结果表明，pmela基因的表达量高低与虹鳟体色具有一定的相关性，且可能参与其体色的形成过程。本研究结果为进一步研究pmela基因在虹鳟体色变异中的作用提供基础资料。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘变芳 郭蔼光 金伟波 范三红
【目的】克隆果蝇抗菌肽Andropin基因,以期利用原核表达系统生产高活性抗菌肽。【方法】首先化学合成了目的基因的2个片段和1对引物,然后利用重叠区互补PCR法得到抗菌肽Andropin的全基因序列。构建了融合表达载体pET32a-Anp,并转入感受态细胞OrigammiB进行原核融合表达。重组菌株诱导表达后,用His-Tag Purification kit亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的蛋白用肠激酶切割并进行活性分析。【结果】在诱导温度37℃、1mmol/LIPTG诱导培养4h的条件下,可获得高效表达的融合蛋白;融合蛋白的表达量占总蛋白的30%,分子质量约为28ku,可溶性达70%以上;抗菌...
[期刊] 水产学报
[作者]
周启苓 马骞 王刘永 毛非凡 杨二军 陈刚
【背景】miRNA作为一类非编码小RNA分子，在脊椎动物骨代谢的分子调控网络中占有重要地位。【目的】本研究旨在探究钙调节因子对硬骨鱼类骨组织miRNA表达水平的影响。【方法】采用鲑降钙素(salmon calcitonin， sCT)对虹鳟幼鱼进行腹腔注射，并在注射24 h后采集鳞组织，利用高通量测序技术和生物信息学方法对其中的miRNA表达谱进行分析。【结果】注射组及对照组样品miRNA测序分别获得14 051 631和15 816 147条高质量miRNA序列(18～26 nt)，并分别从中鉴定出568和592种成熟miRNA。注射sCT后的虹鳟鳞组织中共筛选出24个差异表达miRNA(differentially expressed miRNAs， DEMs)(9个表达上调，15个表达下调)。随后，从中随机选取8个miRNA进行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR， qRT-PCR)检测，其检测结果与高通量测序结果一致。GO注释和富集分析结果显示，DEMs的预测靶基因主要被注释在金属离子结合、钙离子结合、G蛋白偶联受体信号通路、Wnt信号通路和经典Wnt信号通路等功能上，靶基因主要在NF-kappaB输入细胞核的负调节、IL-1β分泌的负调节和TGF-β结合等功能上显著富集。KEGG富集分析结果显示，DEMs的靶基因显著富集在Toll样受体和雌激素等信号通路中。【结论】基于上述分析结果，本研究筛选出omy-miR-29a-5p、omy-miR-30d-5p、omy-mir-125b-2-p3、omy-miR-138、omy-miR-199b-5p和omy-miR-200b等多个可能参与虹鳟骨代谢调控过程的miRNA。【意义】筛选出的差异miRNA可为硬骨鱼类骨代谢调控机制研究提供素材。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王刘永 周启苓 马骞 毛非凡 杨二军 陈刚
为探明鲑降钙素(salmon calcitonin, sCT)对鱼类骨组织钙代谢过程的调节机制,对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)幼鱼进行sCT腹腔注射,并在注射后24 h采集鳞组织进行转录组测序,分析其中长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)表达水平的变化。结果显示,注射sCT后的虹鳟鳞组织中共鉴定出847个差异表达的lncRNA,其中247个表达上调, 600个表达下调。GO注释结果显示,差异表达lncRNA靶基因主要被注释到转录调控、运输、信号转导、膜、细胞质、金属离子结合和核苷酸结合等功能中。KEGG通路富集结果显示,差异表达lncRNA靶基因在硫胺素代谢通路、炎症介质对TRP通道调节、血小板活化、谷氨酸能突触、神经营养因子通路、ARVC通路和NF-kappa B信号通路等通路中显著富集。利用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)对随机选取的6个差异表达lncRNA的表达量进行验证,结果显示, qRT-PCR与RNA-Seq结果一致。基于上述结果,本研究筛选到MSTRG.68909.2、MSTRG.39805.1、MSTRG.121429.1、MSTRG.9137.1和MSTRG.43721.1共5个可能参与虹鳟钙代谢的关键lncRNA,这些关键基因的筛选鉴别可为探明硬骨鱼类骨代谢的调控机理提供新的切入点,为虹鳟养殖生产实践提供参考。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
黄贝 陈善楠 黄文树 聂品
IFN-γ在天然免疫和适应性免疫应答中均发挥着重要的作用。由于低等脊椎动物IFN-γ与哺乳动物IFN-γ相似性非常低,硬骨鱼类的IFN-γ近年来才得到鉴定。本研究报道了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)的IFN-γ基因,并对其表达进行了分析。斜带石斑鱼IFN-γcDNA全长为867 bp,编码200个氨基酸。其基因组全长为5 104 bp,由4个外显子、3个内含子组成。氨基酸序列比对显示斜带石斑鱼IFN-γ与高等脊椎动物IFN-γ的序列相似性较低,仅为32.5%～39%,与其他硬骨鱼类的IFN-γ相似性为38.0%～68.5%。序列分析结果显示,斜带石斑鱼IFN-γ分子C末...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
胡廷章 钟彦 陈林 杨俊年 黄小云
为了研究胚胎发育后期丰富蛋白基因OsLEA2的功能,利用PCR方法扩增目的基因,采用基因重组、蛋白质表达和抗逆性分析对OsLEA2基因进行研究。结果表明,构建的原核表达载体pET32a-OsLEA2,转化到E.coli BL21中,得到表达OsLEA2融合蛋白的工程菌;SDA-PAGE分析表明融合蛋白的分子量约为29.4 kDa。OsLEA2的表达增强了大肠杆菌对高盐、高温、低温和紫外照射等非生物胁迫的抗性。该研究为进一步改良作物品种、提高农作物的抗逆性奠定基础。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王钦 李建林 唐永凯 李红霞 张磊 沈泽恩 俞菊华
[目的]本文旨在获得可溶的鲤鱼(Cyprinus carpio)groupⅢ分泌型磷脂酶A_2(PLA2g3a1)催化活性区(PLA_2 bee venom like region,PBVR)原核重组蛋白,并测定该蛋白的磷脂酶活性。[方法]分别构建标签蛋白小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)、硫氧还原蛋白(thioredoxin A,TrxA)、N利用物质A(N-utilization substance A,NusA)、麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)与PBVR的重组表达质粒,转化入大肠杆菌感受态细胞Transetta(DE3)进行原核表达,比较不同标签蛋白的促溶作用;使用Ni-NTA柱纯化重组蛋白,与BSA蛋白标准品电泳比对确定纯化后蛋白的浓度;采用偶联氧脂合酶法测定PBVR重组蛋白的磷脂酶活性。[结果]促溶作用最高的标签蛋白是NusA,可溶性重组蛋白占总蛋白的95%,其次是MBP和TrxA,分别占87%和47%。综合考量可溶性重组蛋白的得率,选择MBP融合蛋白。重组原核表达蛋白MBP-PBVR的磷脂酶比活力[(13.68±0.12)U·μmol~(-1)]显著高于TrxA-PBVR[(0.94±0.01)U·μmol~(-1)]和NusA-PBVR[(0.93±0.04)U·μmol~(-1)](P
[期刊] 华北农学报
[作者]
张弢
为进一步验证青花菜Bo PGIPl基因的功能,通过RT-PCR方法克隆得到青花菜Bo PGIP1基因完整的编码区序列,将其克隆到原核表达载体p ET28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达Bo PGIP1基因的重组大肠杆菌BL21(p ET28a-Bo PGIP1),重组菌经IPTG诱导表达以及SDS-PAGE电泳检测,结果表明,在37 k Da处有一条特异表达的蛋白质条带,与预期的目的产物大小一致;同时对重组大肠杆菌BL21(p ET28a-Bo PGIP1)的抗逆性进行分析,结果表明,BL21(p ET28a-Bo PGIP1)对Na Cl(0.4 mol/L)、Na ...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭亚格 刘佳隆 齐志颖 何雷 贾艳艳 陈建 陈松彪 廖成水 丁轲 余祖华
【目的】克隆鸡纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein 2,FGL2)基因,并进行生物信息学分析和原核表达,为鸡FGL2蛋白的功能研究奠定基础。【方法】采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术扩增鸡FGL2基因,克隆至pMD19-T载体,测序后对鸡FGL2基因及其编码的蛋白进行生物信息学分析。构建原核表达质粒pET-32a-FGL2,将其转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。【结果】成功克隆了鸡FGL2基因的CDS区,序列全长为1 320 bp,编码439个氨基酸。生物信息学分析显示,鸡FGL2氨基酸与火鸡、雉鸡、珍珠鸡、鹌鹑等禽类的同源性高,达96%以上;与哺乳类动物的同源性较低,其中与犬的同源性仅有64.8%。FGL2蛋白由439个氨基酸组成,理论分子质量为50.24 ku,分子式为C_(2 221)H_(3 451)N_(615)O_(673)S_(22),理论等电点(pI)为8.63,为不稳定的亲水性分泌型蛋白,无跨膜区。成功构建了原核表达质粒pET-32a-FGL2,其在大肠杆菌BL21(DE3)可表达以包涵体形式为主的FGL2融合蛋白,分子质量约为70 ku。【结论】成功克隆出了1 320 bp的鸡FGL2基因,明确了其编码蛋白的生物学信息,经诱导表达后获得FGL2重组蛋白。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
刘飞 王凡 李聪歌 马雅雯 朱荣帅 黄琼波
为了探讨添加红枣提取物对促进虹鳟(Oncorhynchus mykiss)机体健康的可能性,选取体长为7.2～8.4 cm的健康虹鳟,随机分成4个试验组,分别投喂红枣提取物添加量为0%(对照组)、0.25%、0.50%和1.00%的等氮等脂饲料,饲养56 d,养殖结束后测定12项血清生化指标和头肾的6个免疫相关基因mRNA表达量。结果显示:与对照组相比较,血清中肌酐(CREA)和尿素氮(BUN)含量三个红枣提取物组均出现极显著下降;谷丙转氨酶(GPT)活性在0.50%和1.00%组极显著下降,谷草转氨酶(GOT)活性也在0.50%和1.00%组出现了一定程度下降,但差异不显著;酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性无显著变化;总蛋白(TP)和白介素6(IL-6)含量在0.25%组出现显著增加;溶菌酶(LZM)活性三个红枣提取物组均显著升高;超氧化物歧化酶(SOD)活性在0.50%组极显著增加;补体4(C4)和肿瘤坏死因子(TNF-α)含量在0.25%和0.50%组均极显著增加。在头肾中,与对照组相比,SOD、白介素1β(IL-1β)和补体3(C3)基因表达量在0.50%和1.00%组均为显著或极显著上调;Factor H基因表达量在0.50%组显著上调;过氧化氢酶(CAT)和LZM基因表达量在0.50%和1.00%组仅出现差异不显著上调。上述结果表明,在虹鳟饲料中添加一定量的红枣提取物,可以起到促进肾功能,保护肝脏和提高其非特异性免疫功能的作用。
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