采用原核表达系统表达、亲和纯化重组蛋白、Western-blot、MTT比色法及同源模建的方法,分析了新型葡萄球菌肠毒素SEQ的生物学活性及其与结构的关系,预测了发挥超抗原活性的功能位点。结果表明,表达纯化的可溶性重组GST-SEQ、His-SEQ蛋白表达量分别占菌体蛋白的20%和25%,且均具有良好的免疫原性以及诱导小鼠脾淋巴细胞分化增殖的能力,SEQ成熟肽中α-螺旋、β-折叠、无规则蜷曲分别约32,68,116aa;SEQ毒素潜在的与MHCⅡVβ链结合的关键位点为H169、H207、D209,而与TCR的结合域位于α3-β8环区域。2种重组SEQ肠毒素均具有超抗原活性,这与其存在于细胞MH...

【目的】检测奶牛源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)新疆分离株生物被膜、肠毒素基因分布与毒力,分析其内在联系。【方法】采用微量滴定板测定法(MPA)、PCR方法和寇氏改良法分别测定164株S.aureus新疆分离株生物被膜(BF)形成能力、肠毒素基因分布、小鼠半数致死量(LD_(50))和脏器载菌量,观察其病理组织学变化。【结果】164株S.aureus BF阳性率为83.4%,以弱BF(BF~+)菌株为主;肠毒素基因检出率为96.3%,传统肠毒素see和新型肠毒素seg检出率最高,分别为57.3%和81.1%;强BF菌株(BF~(3+))LD_(50)要高于弱BF菌株(BF~+)和阴性菌株(BF~-),但其脏器载菌量低于BF~-菌株(P<0.05)。【结论】奶牛源S.aureus新疆分离株BF阳性菌株所占比例较高,其肠毒素基因携带率也较高。毒力研究表明,S.aureus分离株BF~(3+)菌株脏器载菌量低于BF~-菌株(P<0.05),且随着BF形成能力的增强毒力相应减弱。

【目的】研究食源性金黄色葡萄球菌各血清型肠毒素基因的分布,并进一步分析其时序性表达规律。【方法】针对51株各类食品中分离的金黄色葡萄球菌菌株,应用PCR技术对11种葡萄球菌肠毒素进行基因分型;提取细菌总RNA,以ftsZ和ropB作为内标基因,使用反转录荧光定量PCR研究各肠毒素基因在细菌生长周期中的表达水平变化。【结果】除see、ses和set外,其余8种肠毒素基因在51株食源性金黄色葡萄球菌菌株中均有检出,且sei和seg的检出率最高(27.45%)。各肠毒素基因在mRNA水平的时序性表达规律基本一致,均在对数后期达到峰值,随后快速下降。以内标基因为参照,同一菌株中不同肠毒素基因的相对表达...

【目的】研究溶葡萄球菌素对小鼠肠道菌群结构的影响,为溶葡萄球菌素的食用安全性评估提供参考。【方法】将24只7周龄ICR小鼠随机分为3个试验组和对照组,3个试验组分别提供溶葡萄球菌素含量为1μg/mL(低剂量)、5μg/mL(中剂量)和15μg/mL(高剂量)的饮水10mL/(只.d),于饮用第0(饮用前),1,3,7,14,21天以及停饮第3,7,14天采集小鼠新鲜粪便样品,采用PCR-DGGE技术检测小鼠肠道菌群结构变化。【结果】DGGE图谱显示,各组小鼠试验前后不同时间肠道内的优势菌种相似;经UPGMA聚类分析,与对照组相比,低、中剂量溶葡萄球菌素对小鼠肠道菌群结构影响较小,高剂量溶葡萄球...

用对峙培养法和生长速率法分别测定灰葡萄孢及其毒素对植物病原真菌的抑菌活性 ;用抑菌圈法测定毒素对植物病原细菌的抑菌活性 ;用浸渍法测定毒素的杀虫活性 ;以种子幼根幼芽生长抑制率为活性指标 ,测定毒素对杂草种子发芽力的抑制活性及对农作物种子发芽势的影响 ;在杂草出苗后喷施毒素 ,测定毒素对杂草幼苗的杀伤活性和对出苗后农作物生长的影响。结果发现 ,3d内灰葡萄孢毒素对小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦赤霉病菌的抑制率达 5 6 %以上 ;1d内毒素对马铃薯环腐病原细菌的抑菌圈直径为 6 mm,对白菜软腐病原细菌的抑菌圈直径为 9m m;毒素原液对黏虫、小菜蛾和菜青虫的杀伤活性很小 ,对反枝苋和牵牛花...

【目的】对从原始森林土壤中分离得到的1株抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的放线菌AF1进行分类鉴定,并对其代谢产物活性进行分析。【方法】通过菌株形态学特征、生理生化特征观察和16SrDNA序列分析,对AF1菌株进行分类鉴定;采用琼脂平板打孔法,测定AF1菌株发酵产物的稳定性及AF1菌株发酵产物乙酸乙酯粗提物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌活性。【结果】电子显微镜观察显示,AF1菌株分生孢子直或呈波浪弯曲状,孢子链呈松散螺旋状,AF1菌株能利用葡萄糖、D-半乳糖、麦芽糖、鼠李糖和蔗糖,不能利用D-果糖、D-甘露醇和肌醇,可以水解淀粉但不能水解纤维素。AF1菌株16SrDNA序列全长1 242bp(Ge...

【目的】调查产生生物被膜的金黄色葡萄球菌流行病学特征，探究生物被膜形成能力与分子型之间的相关性，为治疗动物金黄色葡萄球菌感染提供理论依据。【方法】以广东省兽药研制与安全评价重点实验室保存的98株金黄色葡萄球菌为研究对象，用结晶紫半定量法测定所有菌株生物被膜形成能力，将产膜菌株进行22种常见抗菌药的最小抑菌浓度测定，通过金黄色葡萄球菌常见3种（spa、MLST和PFGE）分型方式进行分子分型，并分析产膜能力与分子型之间的相关性，最后通过全基因组测序技术分析生物被膜产生菌株中耐药基因和毒力基因携带状况。【结果】结晶紫半定量结果显示，98株金黄色葡萄球菌中能产生生物被膜的菌株共计23株，占23.47%。包括牛乳源22株（占比25.29%,22/87），其中14株（占比60.87%,14/22）来自浙江奶牛养殖场，8株（占比39.13%,8/22）来自福建奶牛养殖场，以及猪源1株（占比9.10%,1/11），来自广东屠宰场，说明牛乳源金黄色葡萄球菌产膜潜力高于猪源；将产膜能力划分为强、中、弱3个等级，23株产膜菌株中，其中强产膜菌株2株（占比8.70%,2/23），中产膜菌株9株（占比39.13%,9/23），以及弱产膜菌株12株（占比52.17%,12/23）。药敏试验显示，牛乳源产膜菌株对所有受试抗菌药物敏感，而猪源产膜菌株对青霉素、阿莫西林、头孢噻呋、头孢西丁、恩诺沙星、环丙沙星、克林霉素、多西环素、红霉素、氟苯尼考、复方新诺明、泰妙菌素、替米考星13种抗菌药均表现出耐药；spa分型结果显示，98株金黄色葡萄球菌共获得8种spa型，产膜的23株金黄色葡萄球菌占其中3种：1株t2922型来自广东猪源，14株t2119来自浙江牛乳源，8株t189来自福建牛乳源；MLST分型结果显示，98株菌共分为9种ST型，其中6种ST型不具有产生生物被膜的能力，分别为ST398、ST522、ST705、ST1651、ST479和ST151，仅3种ST型的菌株具有生物被膜产生能力，分别为ST9、ST7和ST188。结果表明，强产膜菌株分子型主要为ST7-t2119，中产膜菌株主要为ST7-t2119和ST188-t189，弱产膜菌株为ST9-t2922、ST7-t2119和ST188-t189；同时结合PCA分析不同ST型组间差异性发现，弱产膜菌株的ST型能与中强产膜菌株很好的区分开来，只有特定ST型的金黄色葡萄球菌才具有产生生物被膜的能力。23株产膜菌株PFGE分型全部成功，结果显示，广东、福建、浙江三省产膜菌株共分为3种PFGE型，且PFGE型存在地域分布特征，同一地区的分离株可能存在克隆传播，但克隆株之间生物被膜产生能力有明显差异；全基因组测序结果显示，产膜菌株中耐药基因和毒力基因根据分子型不同携带情况呈现多样性。【结论】不同来源的金黄色葡萄球菌有不同程度产生生物被膜的潜力，且均携带多种不同的产膜基因，牛乳源金黄色葡萄球菌产膜潜力远远高于猪源；菌株能否产膜与ST型存在强相关性，特定的ST型如ST9、ST7和ST188更容易产生生物被膜。

【目的】了解陕西关中地区猪肉中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的污染状况、耐药性及其毒素基因的分布。【方法】采集陕西关中6个地区的猪肉165份,按国标GB/T 4789.10-2010的方法,对其中的金黄色葡萄球菌进行分离,采用PCR方法对该菌进行确证并对其相关基因(如nuc、mecA、PVL、SEs和ETs)进行检测,最后采用琼脂稀释法检测金黄色葡萄球菌对11种抗菌药物的耐药性。另外,在BP平板中分别添加头孢西丁(4μg/mL)和苯唑西林(4μg/mL),分离耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。【结果】165份样品的金黄色葡萄球菌污染率为33.33%(55/16...

【目的】研究临床分离的奶牛乳腺炎葡萄球菌生物被膜形成能力,相关基因的分布及二者之间的关系;【方法】利用通用硅胶片法培养葡萄球菌生物被膜,经充分洗涤后对生物被膜进行银染定性判断菌株形成生物被膜的能力,通过生物被膜菌落结晶紫染色法定量检测菌株生物被膜的形成能力,并用扫描电镜观察被膜结构,对葡萄球菌bap、icaAD、icaBC、sar、agr、sigB、clfaA、clfaB、fnbpA和fnbpB进行PCR扩增检测。【结果】银染法定性结果显示137株葡萄球菌中有120株形成肉眼可见的生物被膜,生物被膜形成率为87.6%;结晶紫染色定量检测与硅胶粘附的有132株,不粘附的有5株。试验所用的137株...

【目的】实现牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组β-溶血素的溶血活性。【方法】PCR扩增牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因,构建原核表达载体pET32a+/hlb,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,用96孔血凝板测定重组蛋白的溶血效价,以血琼脂平板法检测重组蛋白的CAMP反应。【结果】测序结果表明,扩增片段含有993bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白;SDS-PAGE分析重组蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为57kD,表达量占菌体总蛋白的23.9%;溶血效价分析,金葡菌β-溶血素对绵羊红细胞的溶血效价为278HU·mg-...

根据GenBank上发表的金黄色葡萄球菌β-溶血素基因序列,设计了一对特异性引物。提取临床乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌山东株zfb的全基因组DNA为PCR模板,扩增β-溶血素基因,将PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体中。测序结果表明,扩增片断含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸和1个终止子的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白的氨基酸组成同源性为99.4%。软件分析显示,克隆的金葡菌β-溶血素是一种依赖于金属离子的磷脂酶。上述结果显示,已获得金黄色葡萄球菌β-溶血素基因,为获得重组金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白及对其结构和功能的研究奠定了基础。

【目的】研究枯草芽孢杆菌素(Bacillus subtilis bacteriocin)Subticin112在体内外对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CVCC 1885的抑菌活性(bacteriostatic activity),为Subticin112的临床应用提供理论依据。【方法】体外抑菌:取相同有效质量的Subticin112、土霉素、青霉素、万古霉素、新霉素、链霉素和庆大霉素等分别溶于等体积的无菌生理盐水中,然后采用琼脂扩散法比较相同浓度的上述药物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。体内抑菌:将体重为18-22 g的SPF级KM雄鼠120只分成6组,分别为空白对照...

【目的】克隆金黄色葡萄球菌血浆凝固酶(Coa)基因,并在大肠杆菌中进行融合表达,分析重组蛋白的生物活性。【方法】用PCR法扩增金黄色葡萄球菌Coa基因,构建Coa基因原核表达载体pET32a(+)/coa,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,采用SDS-PAGE法分析重组蛋白的表达水平;将重组蛋白纯化后,测定其血浆凝固效价。【结果】扩增出了2 106 bp的Coa基因,其包含1个完整的开放阅读框,编码含701个氨基酸的成熟多肽;IPTG诱导后该基因表达的融合蛋白分子质量为100 ku,目的蛋白产量占菌体总蛋白的13%;纯化的重组蛋白含量为0.047 mg/mL,其对兔血浆凝固效价为0....

【目的】制备金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A(FnbpA)基因工程亚单位疫苗,并以小白鼠为试验模型,检测其免疫保护效果。【方法】诱导表达FnbpA,经组氨酸标签亲合纯化后用Bradford法测定纯化的目的蛋白的含量,并检测其黏附活性及对动物的安全性。制备FnbpA亚单位疫苗,经无菌检验及安全检验后,进行免疫保护试验,用ELISA方法检测被免疫小鼠血清中的抗体效价,通过腹腔攻毒试验检测疫苗的免疫保护力。【结果】纯化的目的蛋白在80 ku处出现单一条带,蛋白质量浓度为0.245 mg/mL。细菌黏附抑制试验发现,经FnbpA蛋白预处理过的MDBK细胞黏附的金黄色葡萄球菌数较对照极显著减少;动物安全...

对灰葡萄孢BC4菌株进行紫外线诱变得到了15个诱变菌株,经测定筛选出BC4-1、BC4-2和BC4-15等3个诱变菌株中以BC4-1菌株效果最好。试验发现,用于毒素产生的PD培养基的pH值对产毒能力影响很大,以pH4.0最优。用三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯萃取培养滤液制备BC-粗毒素,生物测定结果表明,以乙酸乙酯萃取所得粗毒素对杂草种子萌发及生长抑制作用最强。通过柱层析法和HPLC法分离和纯化除草活性组分,得到1个在271nm有最大UV吸收的化合物,该组分在100mg·L-1浓度下对马唐的生长具有强烈的抑制作用,在50mg·L-1浓度下可完全抑制马唐和反枝苋种子的萌发。