对主要用于我国高致病性禽流感防控的重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的种类和使用情况,以及国内高致病禽流感流行株的主要分支情况作一介绍。随着病毒抗原性的不断变异,疫苗毒株也需随之进行更换,因此必须使用匹配相应分支的疫苗才能取得理想的防控效果。目前国内重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的生产现状是共有10家生产企业,其中2个厂家采用悬浮细胞工艺生产,其余8个厂家均采用鸡胚工艺进行疫苗生产。笔者根据企业上报的产品批签发报告情况,以2016年至2017年农业部规定的高致病性禽流感强制免疫疫苗重组禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株+Re-8株)为例,着重从疫苗的安全性和效力两方面对4家重组禽流感灭活疫苗生产企业共计488批次产品的批签发检验数据进行了质量分析。从Re-6株、Re-7株、Re-8株不同组分效价的比较可以看出,所有批次疫苗抗体效价几何平均滴度(GMT)至少高于国家标准1个滴度以上,而Re-6株和Re-8株组分抗体效价(GMT)高于国家标准2个滴度以上。虽然产品的效价都超过了国家标准,但抗体水平还是参差不齐,较高产品的3个组分抗体效价(GMT)比较低的要高出1.5个滴度以上。各生产企业产品批间差异较大,这虽有生产工艺不断成熟和优化的因素,但对于相近批次产品批间差异出现较大差异,则说明企业生产工艺并不十分稳定。4个企业在2017年生产的疫苗各组分抗体效价GMT整体水平均比2016年有所提高,说明生产工艺的不断成熟和优化,企业对产品质量的进一步严格把关。我国禽流感病毒灭活疫苗含有的甲醛和细菌内毒素是造成疫苗副反应的直接原因,因此通过生产工艺改进,降低疫苗中甲醛和细菌内毒素的含量,可以降低疫苗的副反应。核酸疫苗是当前禽流感疫苗研究发展的前沿技术,是现阶段禽流感疫苗硏制中最具理想前景的疫苗,也是禽流感疫苗研究的一大热点。另外,具有交叉保护性的广谱免疫原性的通用疫苗可以有效的解决抗原漂移这一难题,是现阶段流感疫苗研究的一个重要研究方向。

以H5N1亚型禽流感病毒接种鸡胚 ,收取鸡胚液为抗原研制了禽流感灭活疫苗 ,并对制苗抗原以及疫苗的物理性状、安全性、免疫效力、免疫剂量和保护期等进行了试验。结果表明 ,获得了较高效价的制苗抗原 ,灭活前后HA分别为 2 10 0～ 11 0 和 2 9 0～ 10 0 。试制疫苗物理性状符合要求 ,安全性良好。试验鸡在免疫 14d后血清抗体达到2 7 5,2 10d血清HI抗体仍维持在 2 5 0 左右 ;免疫后 18d使用高致病性H5亚型禽流感病毒攻毒 ,获得 10 0 %的保护。分别使用 0 1,0 3和 0 5mL免疫鸡 ,发现 0 3～ 0 5mL剂量组免疫后血清抗体达到...

【目的】为评估细胞源重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的有效性提供数据支持。【方法】选取一株来源清楚的贴壁MDCK细胞,通过逐步降低培养基中血清含量及不断调整无血清培养基配方,将其驯化为悬浮MDCK细胞,并以此为基质增殖重组禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株和H5N1 Re-8株;比较不同毒株在贴壁和悬浮MDCK细胞中增殖的差异。分别将经悬浮MDCK细胞增殖的病毒与经SPF鸡胚增殖的病毒制备成重组禽流感病毒(H5亚型)三价灭活疫苗,免疫商品蛋鸡和商品鸭,通过血清学方法比较细胞源与鸡胚源禽流感灭活疫苗的免疫效果。海兰褐商品蛋鸡:6 050只,分为3组,2组为免疫组,每组3 000只,28日龄免疫0.5 mL/只,80日龄免疫0.5 mL/只;不免疫对照组1组,50只,同等条件下隔离饲养。分别于蛋鸡日龄49、110、210 d(即首免后21 d、82 d、6个月)时采血分离血清,测定禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株的HI抗体效价,监测抗体消长。长白飞鸭:220只,分为3组,2组为免疫组,每组100只,10日龄免疫0.5 mL/只,24日龄免疫1.0 mL/只,不免疫对照组20只,同等条件下隔离饲养。分别于鸭日龄24、38、52 d(即首免后14、28、42 d)时采血分离血清,测定禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株的HI抗体效价,监测抗体消长。【结果】获得一株可在无血清培养基中悬浮生长的MDCK细胞,摇瓶、5L生物反应器中的培养数据及细胞状态显示,该细胞株适合放大生产。此悬浮MDCK细胞培养48 h细胞密度可由1.5×10~6 cells/mL左右增殖到1.0×10~7 cells/mL左右,状态良好、活率高、单个悬浮于培养基中。以此悬浮MDCK细胞为基质增殖重组禽流感病毒,H5N1 Re-6株的HA效价达1﹕512,TCID_(50) 10~(7.67)/mL,EID_(50) 10~(7.83)/0.1 mL;H5N1 Re-7株的HA效价达1﹕256,TCID_(50)达10~(7.33)/mL,EID_(50)10~(7.17)/0.1 mL;H5N1 Re-8株的HA效价达1﹕1024,TCID_(50) 10~(8.5)/mL,EID_(50) 10~(8.38)/0.1 mL,与经贴壁MDCK细胞增殖的病毒毒价相当。细胞源三价灭活疫苗免疫海兰褐商品蛋鸡,首免后21 d时,禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕446、1﹕111、1﹕416,二免后30 d时三者HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕588、1﹕362、1﹕776,6个月时分别为1﹕239、1﹕128、1﹕223,维持了较高的抗体水平;免疫长白飞鸭,首免后14 d时,禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕30、1﹕17、1﹕64,28 d时三者HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕194、1﹕91、1﹕137,42 d时分别为1﹕416、1﹕128、1﹕239;以上两组的试验结果与鸡胚源重组禽流感灭活疫苗免疫后诱导产生的HI抗体效价相当。【结论】经驯化获得的可在无血清培养基中悬浮生长的MDCK细胞株,其增殖重组禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株、H5N1 Re-8株能力强,且病毒被制备成灭活疫苗免疫海兰褐商品蛋鸡和长白飞鸭可产生较高水平的抗体。为大规模工业化生产禽流感疫苗提供技术支持。

本试验利用蔷薇科植物提取物(SHY)分别与新城疫、禽流感H9、H5亚型病毒作用后,接种10 d SPF鸡胚,评价SHY对病毒的抑制作用;给21 d SPF鸡连续口服该中药提取物5 d后,分别用新城疫、禽流感病毒攻击,观察对SPF鸡的保护作用。结果表明:SHY测试剂量对SPF鸡胚没有毒性;20、10、5和2.5 mg/mL提取物与一定量的新城疫、禽流感H9亚型病毒作用后,鸡胚全部存活,病毒测定为阴性;与禽流感H5亚型病毒作用后,2.5 mg/mL组不能完全保护鸡胚存活(6/8),病毒分离阳性。在攻毒试验中,SPF鸡分别按60、50、40和20 mg口服后,用新城疫和禽流感H9亚型攻毒保护分别为5...

【背景】H9亚型禽流感病毒(AIV)存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒(DEV)属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10~3 TCID_(50)免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量(10~3-10~6TCID_(50))rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制(HI)抗体,并在免疫后28 d,以10~8EID_(50)的剂量静脉注射H9N2AIV(A/duck/GD/08),攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10~3 TCID_(50)免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-Δg E-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10~3TCID_(50)剂量免疫组HI抗体效价达到1:24,而10~4-10~6TCID_(50)剂量免疫组HI抗体效价在1:2~(2.4)-1:2~3。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10~3、10~4、10~6TCID_(50)免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10~5TCID_(50)免疫组保护率为80%(4/5),1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。

［目的］本文旨在了解Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒神经氨酸酶（ＮＡ）基因的遗传特点和变异情况。［方法］选择２００８—２０１３年从江苏、安徽和浙江省家禽中分离的１１株Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒，用ＲＴ－ＰＣＲ方法对ＮＡ基因片段进行扩增、克隆和序列测定，并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性及遗传进化分析。［结果］１１株毒株的ＮＡ基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为８６．２％～９９．５％和８６．９％～９９．１％，均属于欧亚分支。其中９株鸡源毒株属于Ｙ２８０－ｌｉｋｅ亚系，在ＮＡ蛋白颈部６３～６５位点缺失了３个氨基酸；２株鸭源毒株属于Ｇ１－ｌｉｋｅ亚系，在颈部３９～４０位点缺失了２个氨基酸。１１株分离株除．．．

为了解湖北鸡源禽流感病毒的遗传进化和氨基酸变异情况,将分离到的2株禽流感病毒进行全基因组测序及遗传进化分析。利用RT-PCR扩增流感病毒基因组片段,PCR扩增流感病毒片段、克隆至pMD18-T载体,并对序列特征进行生物信息学分析。结果表明:分离到的2株病毒高度同源,其HA和NA基因属于Y280谱系,PB1、PA、NP和NS基因属于SHF98-like谱系,PB2和M基因属于G1-like谱系;HA裂解位点均为-RSSR↓GLF-,具有低致病性流感病毒的分子特征;在HA蛋白上比当前流行株Y280多了一个潜在糖基化位点313(NCS);在234位点(对应H3编号中的226)产生了从Q到L的突变;在M2蛋白的31位点均产生了从S到N的突变。该2株H9N2亚型流感病毒为Y280谱系的病毒,这提示湖北地区可能也流行Y280-like分支禽流感病毒,虽然属于低致病性禽流感病毒(Low pathogenic AIV,LPAIV),但具有感染哺乳动物的潜在风险。

【背景】H6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）广泛流行于我国南方地区，是我国家禽中最常见AIV之一。H6N1亚型AIV频繁地与其他野鸟源毒株重配，并且可以作为供体为高致病性AIV提供内部基因片段，产生新型重组病毒，进而威胁人类健康。【目的】通过对我国H6N1亚型AIV的演化动态及其相关生物学特性分析研究，为我国禽流感的综合防控提供数据支持。【方法】采集2019—2022年我国25个省（直辖市、自治区）的活禽交易市场及养殖场家禽喉和泄殖腔拭子，通过接种鸡胚分离到7株H6N1亚型AIVs并对其进行全基因组测序，分析其遗传演化特征、受体结合特性及其对SPF鸡和BALB/c小鼠的感染性。【结果】遗传演化分析表明，7株病毒的基因与分离于北美及东南亚地区的野鸟源病毒基因同源性较高，基因来源复杂，具有明显的遗传多样性。贝叶斯演化分析表明，H6亚型AIV HA基因曾发生过多次的跨洲际传播，欧亚谱系病毒在北美地区也有着较长时间流行。1株病毒HA基因与北美地区毒株基因高度同源，根据贝叶斯演化分析结果，推测该病毒在野鸟体内经历了复杂的基因重配后形成，后经野鸟传入我国。特殊氨基酸位点分析结果显示，病毒HA蛋白裂解位点序列均为PQIETR↓GLF，符合低致病性AIV特征；此外，另有1株病毒的NP蛋白发生Y52H突变，据报道，该突变对AIV获得抵抗人干扰素刺激基因BTN3A3的能力起到关键作用。受体结合特性分析表明，部分毒株具有双受体结合特性，但结合人源受体能力弱于结合禽源受体能力。病毒对SPF鸡的感染性试验表明，鸡感染A/chicken/Jiangxi/S40445/2019(H6N1)后能通过呼吸道及消化道排毒，并且病毒可在鸡群内通过接触传播。鸡感染A/duck/Jiangxi/S10941/2019(H6N1)后仅有少数鸡通过呼吸道排毒，病毒无法在鸡群间通过接触传播。BALB/c小鼠的感染性试验表明，H6N1亚型AIV无需提前适应便可在小鼠呼吸道内有效复制，但对小鼠仍呈低致病力。【结论】2019—2022年分离于我国的H6N1亚型AIV基因大部分来源于野鸟源病毒，候鸟可经东亚-澳大利亚迁徙路线将病毒传入我国；部分病毒能够结合人源唾液酸受体并在小鼠呼吸道内有效复制，表明该亚型病毒对公共卫生安全构成潜在威胁。

【目的】为了验证H5N1亚型禽流感病毒对鸭是否具有致病作用。【方法】对2003年某地方养鹅场发病鹅群分离的一株H5N1亚型流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/2003的生物学特性和致病性进行研究。【结果】动物实验表明该病毒对不仅对鸡具有高致病性(IVPI=3),而且对鸭也具有高致病性。雏鸭人工感染该病毒后临床表现典型的神经症状,剖检可见脑膜点状出血,肝脾肿大并见有坏死灶,肺脏严重充血、出血,消化道粘膜弥散性出血。病理组织学检查发现全身各脏器以出血、充血、细胞变性坏死和炎性细胞浸润为主要特征,并表现为不同程度的损伤。感染鸭死亡集中在感染后的4～6d,致死率75%。雏鸭在病毒感染后2～4d的气...

参考GenBank上发表的H5亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)基因序列设计引物,PCR扩增NA基因,再将其克隆到原核表达载体pET-32a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为61 kDa,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV神经氨酸酶抗体具有良好的灵敏性。

【目的】验证斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒的易感性,测定斑鸠呼吸道上皮细胞表面流感病毒受体的类型和分布。【方法】以5×104EID50/只的剂量经滴鼻、点眼途径感染A/Chicken/Beijing/2/2009(H9N2)亚型禽流感病毒,共感染8只斑鸠和8只SPF鸡,对试验斑鸠和SPF鸡进行临床症状、大体病变、组织学病变的观察及病毒抗原的定位、病毒分离和感染抗体的测定。【结果】攻毒后5d,斑鸠和SPF鸡未见异常临床表现和大体病变,病理组织学检查发现斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞均有不同程度的脱落;在斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞的胞浆内检测到了大量阳性流感病毒蛋白颗粒;斑鸠...

为了阐明新疆油鸡H9亚型流感病毒PB1基因的分子特征与进化趋势,本研究采用RT-PCR技术对新疆油鸡分离株A/Chicken/Xinjiang Baicheng/1/2014(H9 N2)的PB1基因进行了克隆、测序及分子进化分析,将PB1基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列与Genbank中已经公布的参考序列进行同源性比较。结果表明,新疆油鸡分离株的PB1基因由2274个碱基组成,编码757个氨基酸,与AIV A/chicken/Henan/89/2013(H7N9)的PB1基因处于同一分支,其核苷酸和氨

【目的】禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)根据其表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸(neuraminidase,NA)的不同,可分为16种HA和9种NA亚型。根据其致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus,LPAIV)。虽然H4亚型禽流感病毒为低致病性AIV,感染家禽表现为无症状感染,但其对禽类甚至是哺乳动物是一个潜在的威胁,因此必须要加强对H4亚型禽流感...

【目的】了解近年来中国H9N2亚型禽流感病毒毒力变化和抗原性变异的特点,【方法】对分离于1998—2008年间的25株H9N2亚型禽流感病毒分离株进行了EID50、ELD50、MDT、ICPI、IVPI和8周龄SPF鸡人工感染排毒试验,测定了部分分离株与抗H9N2亚型禽流感病毒Hp参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制(HI)和中和反应特性,对具有不同反应特性分离株的HA基因进行了序列分析。【结果】不同分离株呈现致病力差异,具多态性特征,3#、12#和14#分离株致病力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,人工感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长。3#和12#分离株与单抗2A4和F6呈现...

【目的】我国批准使用的H9亚型禽流感（avian influenza,AI）商品化灭活疫苗种类繁多，其免疫效果和选用受到养殖者的广泛关注。通过评估不同商品疫苗对我国近期H9N2亚型AIV的免疫保护效果，以期为H9亚型AIV的免疫防控提供科学参考。【方法】依据国家兽药基础数据库疫苗批签发数据，从在售的40种H9亚型AI商品疫苗中选择批签发数量较多的4种疫苗（A—D疫苗），进行免疫攻毒试验。4株h9.4.2.5分支的H9N2亚型分离株CK/XJ/S1204/2015、DK/JX/S4512/2017、CK/YN/S1666/2020和CK/NX/S4590/2020为攻毒毒株，分别测定4株病毒的鸡胚半数感染量（EID_(50)）、鸡半数感染量（CID_(50)）和细胞半数感染量（TCID_(50)），以确定动物试验的攻毒剂量和细胞试验的感染剂量。每种疫苗以产品推荐剂量免疫3周龄SPF鸡各40只，同时设同日龄SPF鸡40只接种PBS作为对照组；免疫3周时，采集所有试验鸡血清，测定血凝抑制抗体（HI）和中和抗体（NT）滴度；同时将每种商品疫苗接种40只SPF鸡进行随机分组，每组10只，连同10只对照组鸡，以10 CID_(50)的剂量鼻腔感染H9N2亚型分离株，分别进行商品疫苗对4株病毒的攻毒保护试验。采集攻毒后3、5 d喉头及泄殖腔棉拭子样品，接种10日龄鸡胚检测排毒情况，统计疫苗保护率，比较疫苗对H9N2亚型分离株的免疫保护效果。【结果】4株H9N2亚型分离株的CID_(50)依次为10~(3.5)、10~(2.5)、10~(2.5)和10~(3.5) EID_(50)/0.1 mL。商品疫苗接种后3周，各免疫组SPF鸡血清中针对商品化H9亚型HI试验抗原（CK/SH/10/2001）的HI抗体均在9.4 log_2—11 log_2之间，但针对攻毒株的HI抗体平均效价在4.6 log_2—10.8 log_2之间，不同疫苗免疫组间存在较大差异，最大差异为64倍，各免疫组NT抗体平均效价在6.7 log_2—12.2 log_2之间，最大差异为32倍，对照组鸡的HI抗体和NT抗体均为阴性。以滴鼻方式感染不同H9病毒后，4种疫苗的免疫保护效果存在较大差别，在攻击CK/XJ/S1204/2015毒株的试验中，3种疫苗（B—D疫苗）能为免疫鸡提供80%以上保护；在攻击DK/JX/S4512/2017毒株试验中，仅1种疫苗（B疫苗）能为免疫鸡提供80%以上保护；在攻击CK/YN/S1666/2020毒株的试验中，2种疫苗（A和B疫苗）能为免疫鸡提供80%以上免疫保护；而攻击CK/NX/S4590/2020毒株，4种疫苗免疫鸡的保护率均低于80%，而同期各对照组鸡均排毒，排毒率均高于80%。【结论】不同商品疫苗预防近期H9亚型分离株感染的免疫保护效果存在较大差异，疫苗抗原与分离株之间的抗原性差异是免疫保护率降低的主要原因；使用H9N2亚型流行毒株测定免疫后的HI抗体和NT抗体可作为评价商品疫苗免疫保护效果的重要依据。本研究为商品H9疫苗的科学选用提供重要参考。