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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
欧艳梅 许晓东
【目的】构建包含Ｓｆ－ｃａＳｐａＳｅ－１反向重复序列的重组杆状病毒ｖａｃＭＮｐｖ－ｄＳｃａＳｐ，并在草地贪夜蛾（Ｓｆ９）细胞中表达Ｓｆ－ｃａＳｐａＳｅ－１双链ＲＮａ，用以抑制Ｓｆ９细胞的凋亡，为未来优化杆状病毒表达系统提供试验依据。【方法】将Ｓｆ－ｃａＳｐａＳｅ－１反向重复序列构建到ｐＢａｃ５上，与ａｃＭＮｐｖ ＢａｃＭｉｄ共转染Ｓｆ９细胞产生重组杆状病毒，用ＲＴ－ｐｃＲ和ｐｉ活细胞染色方法，分别检测Ｓｆ－ｃａＳｐａＳｅ－１ＭＲＮａ含量及Ｓｆ９细胞的凋亡情况。【结果】ｐｃＲ和双酶切检测结果表明，成功构建了重组质粒ｐＢａｃ５－ｄＳｃａＳｐ，并得到重组杆状病毒ｖａｃＭＮｐｖ－ｄＳｃａＳｐ。ｐｉ染色．．．
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李兰 郑其升 张元鹏 李鹏成 肖希龙 付言峰 侯继波
为研究重组猪肺表面活性蛋白A(RpSP-A)的抗病毒活性,采用Bac-to-Bac系统对RpSP-A蛋白进行表达。首先PCR扩增目的基因并将其克隆至pFastBac1转移载体获得pFast-SP-A,通过转化DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBV-SP-A,在sf9细胞上进行目的蛋白的表达,经镍柱纯化、脱盐柱处理后,采用蚀斑减少方法评价RpSP-A对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用。结果显示RpSP-A在sf9细胞中得到正确表达,并且能够降低PR
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
冯平 李云章 孙丰廷 屈雷 闫海龙
【目的】克隆分析羊口疮病毒（ORFV）榆林株（ORFV-Yulin）的F1L基因序列，通过昆虫杆状病毒表达B2L和F1L串联基因。【方法】采用PCR方法扩增ORFV-Yulin株F1L全长基因，测序后对其进行序列分析和遗传进化分析。扩增ORFV-Yulin株B2L融合基因（rB2L）和 F1L融合基因（cF1L），利用碱基linker连接，通过重叠PCR方法扩增获得ORFV rB2L-linker-cF1L重组基因(rB2Lc-F1L)，将其与昆虫杆状病毒表达载体pBac5连接构建表达载体pBac-r
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
冯平 李云章 孙丰廷 屈雷 闫海龙
【目的】从榆林市具有典型羊口疮症状的陕北白绒山羊唇结痂病料中分离羊口疮病毒(Orf virus,ORFV),克隆分析其B2L基因序列,并通过昆虫杆状病毒表达B2L基因。【方法】利用牛肾传代细胞进行ORFV的分离培养,通过PCR的方法从分离到的病毒中扩增出B2L全长基因,测序后进行序列及遗传进化分析。利用扩增所得的B2L基因构建昆虫杆状病毒表达载体,包装出杆状病毒后侵染sf9细胞,并通过SDS-PAGE、Western-blot以及质谱鉴定等方法验证目的基因的表达情况。【结果】成功分离出1株羊口疮病毒,命名
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
袁哲明 游兰韶
从亲本病毒及其启动子的选择 ,外源毒素基因、昆虫专性激素和酶基因、增效基因、标记基因、宿主反义RNA基因的引入 ,病毒自身基因的修饰以及重组病毒的安全性等方面综述了该领域的最新研究进展 .
关键词：
昆虫杆状病毒 重组病毒 基因工程
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李响 张小涵 李美琪 陈冉 冯颖 李林 桑晓宇 杨娜
为构建可溶性表达弓形虫MIC1蛋白质的重组杆状病毒株并分析重组蛋白质的活性，通过PCR扩增弓形虫mic1基因的编码序列并连接到pFastBac 1质粒中，将重组的转移质粒转化DH10Bac感受态细胞，通过蓝白斑筛选获得重组杆粒，转染Sf9细胞后连续培养3代获得重组杆状病毒株。结果显示，Sf9细胞在感染后的第3天出现典型的细胞病变；间接免疫荧光和Western blot试验结果表明MIC1重组蛋白质在感染的Sf9细胞中成功可溶性表达；纯化的MIC1重组蛋白质不仅具有结合唾液酸乳糖的能力，同时能够刺激Balb/c小鼠产生较高水平的特异性抗体（>1∶25 600）。以上结果表明，通过杆状病毒表达系统可获得具有生物学活性的弓形虫MIC1重组蛋白质。
[期刊] 华北农学报
[作者]
田飞鹏 曹轶梅 卢曾军 孙普 高云英 刘在新
构建共表达O型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白前体P12A和蛋白酶3C的重组杆状病毒,为进一步研究FMDV空衣壳抗原和基因工程亚单位疫苗奠定基础。从质粒T-OP1中扩增出编码O型FM-DV衣壳蛋白前体的P12A基因,并将其插入到杆状病毒转移载体pFastDual-3C的PH启动子之下,构建重组杆状病毒转移载体pD-P12A3C。通过在大肠杆菌内转座重组,获得重组杆粒B-P12A3C,转染Sf9细胞,获得表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒。重组杆状病毒经增殖并感染Sf9细胞后,通过双抗体夹心ELISA方法及间接免疫荧光来检测目的蛋白的表...
关键词：
口蹄疫病毒 衣壳蛋白 重组杆状病毒 构建
[期刊] 华北农学报
[作者]
王凤芝 温立斌 何孔旺 姚火春 王小敏
为了鉴定类猪圆环病毒P1 VP1蛋白能否在体外自组装成病毒样颗粒(VLPs),首先PCR扩增P1 ORF1基因,利用p Fast BacTM1载体构建重组质粒,通过脂质体转染在Sf9细胞中表达P1 ORF1基因。然后通过RT-PCR技术及Western Blot分别从转录和蛋白质水平上鉴定该基因的表达,应用透射电镜观察该蛋白质是否形成了VLPs。结果显示,转染Sf9细胞后,第5天开始出现细胞病变;从接毒细胞中提取总RNA,经Recombinant DNaseⅠ处理除去基因组DNA后,RT-PCR能够扩增出362 bp的目的片段;收获接毒后72 h的细胞,Western Blot分析显示,P1 ...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
林董 何柳 谢荔岩 吴祖建 林奇英 谢联辉
应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的4个基因NS2、NS3、CP和SP,并将它们克隆至pMD-18-T载体上.得到的重组质粒pMD-18-T-NS2、pMD-18-T-NS3、pMD-18-T-CP和pMD-18-T-SP经XbaⅠ/HindⅢ双酶切,分别与经相同方法酶切的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa california nuclear polyhedrosis virus,AcM-NPV)转移载体pFastBacHTb相连接,构建重组转移质粒pFastBacHTb-X(pFastBacHTb-NS2、p...
[期刊] 林业科学研究
[作者]
亓倩 于淑惠 孙涛 王雪庆 刘博文 杨璞 陈晓鸣
［目的］本研究欲利用Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ表达系统，在Ｓｆ９细胞中表达ＷＳ。［方法］将ＷＳ编码序列克隆到质粒ｐ ｆａＳｔＢａｃ～（ｔＭ）Ｈｔ Ｂ后，转化大肠杆菌ＤＨ１０Ｂａｃ～（ｔＭ），经抗性和蓝白斑筛选，获得重组杆粒ｒ ＢａｃＭｉＤ／ＥｐＥｌ ＷＳ。将ｒ ＢａｃＭｉＤ／ＥｐＥｌＷＳ转染Ｓｆ９细胞。［结果］免疫荧光标记检测表明：ＷＳ在受感染细胞的细胞质中表达。［结论］本研究成功表达了白蜡虫ＷＳ，为白蜡虫ＷＳ的生化特性研究奠定了基础。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
朱善元 王安平 吴双 王永娟 左伟勇 洪伟鸣
根据禽腺联病毒Rep基因序列设计2对引物,分别扩增出Rep78和Rep52基因,将其克隆至杆状病毒双表达载体pFastBacDual,获得重组穿梭质粒pFastBacDual-Rep,将其转化到E.coli DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组病毒表达质粒rBacmid-Rep。在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-Rep。SDS-PAGE结果分析表明,Rep78、Rep52均获得了表达,Western blot结果显示表达的重组蛋白能够与Rep52多抗反应,具有良好的反应原性。结论:禽腺联病毒的非结构蛋白Rep78、Rep52基因在昆虫细胞中获得了...
关键词：
禽腺联病毒 Rep基因 昆虫细胞 表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张星朗 高志 杨平凹 周小愿 贾秋红 韩亚慧 高宏伟
为研制基于杆状病毒表达系统的大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,CGSIV)新型亚单位疫苗,将CGSIV主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因克隆至杆状病毒穿梭载体p Fast Bac1质粒中,构建了重组质粒p Fast Bac-MCP。转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经PCR筛选和测序获得了阳性重组杆粒r Bacmid-MCP,在昆虫细胞转染试剂介导下将该重组杆粒转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
范国成 高芳銮 黄美英 谢荔岩 吴祖建 林奇英 谢联辉
为构建携带水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)主要内层衣壳蛋白S3基因和外层衣壳蛋白S8基因的重组杆状病毒,将目的基因(S3和S8)分别亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual多角体启动子(PH)和p10启动子的下游.经酶切和确证性序列测定,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,获得重组杆粒rbpFBDS3-S8,采用脂质体转染法,将rbpF-BDS3-S8转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞包装病毒,PCR筛选鉴定重组病毒.结果表明:Sf9昆虫细胞被侵染72 h后,倒置显微镜下观察到细胞增大,培养液和细胞内出现颗粒状物...
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵洁 梁爱华 付月君
为了研究Bm K IT提高Ac MNPV抗虫活性的作用机制,将Bm K IT基因插入到Ac MNPV中形成重组病毒。采用重组单价病毒Ac MNPV-Bm K IT(IE1)、Ac MNPV-Bm K IT(P10)、Ac MNPV-Bm K IT(PH)和一种重组双价病毒Ac MNPV-Bm K IT(P10)-vcath(PH),通过四唑盐比色法(MTT)和蛋白质印迹法(Western Blot)分析了Bm K IT在Ac MNPV的3个启动子调控下对Sf9细胞增殖和细胞凋亡的影响,结果显示,感染病毒36,48 h Bm K IT在不同启动子调控下表达量从高到低依次为PH、P10、IE1。同...
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵洁 梁爱华 付月君
为了研究Ｂｍ Ｋ ＩＴ提高Ａｃ ｍＮＰＶ抗虫活性的作用机制，将Ｂｍ Ｋ ＩＴ基因插入到Ａｃ ｍＮＰＶ中形成重组病毒。采用重组单价病毒Ａｃ ｍＮＰＶ－Ｂｍ Ｋ ＩＴ（ＩＥ１）、Ａｃ ｍＮＰＶ－Ｂｍ Ｋ ＩＴ（Ｐ１０）、Ａｃ ｍＮＰＶ－Ｂｍ Ｋ ＩＴ（ＰＨ）和一种重组双价病毒Ａｃ ｍＮＰＶ－Ｂｍ Ｋ ＩＴ（Ｐ１０）－ＶｃＡＴＨ（ＰＨ），通过四唑盐比色法（ｍＴＴ）和蛋白质印迹法（ＷＥｓＴＥｒＮ ＢｌｏＴ）分析了Ｂｍ Ｋ ＩＴ在Ａｃ ｍＮＰＶ的３个启动子调控下对ｓｆ９细胞增殖和细胞凋亡的影响，结果显示，感染病毒３６，４８ Ｈ Ｂｍ Ｋ ＩＴ在不同启动子调控下表达量从高到低依次为ＰＨ、Ｐ１０、ＩＥ１。同．．．
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