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[期刊] 中国农业科学
[作者]
郭爱疆 才学鹏 贾万忠 房永祥 乔军 刘红霞 潘小梅 景志忠
【目的】克隆猪囊尾蚴AgB基因并在体外细胞中表达。【方法】采用RT-PCR法分别扩增AgB基因的上半段和下半段序列。采用重叠延伸PCR法(splicing overlap extension PCR method,SOE-PCR)把具有35个相同碱基的上下半段扩增为全长基因,并构建到真核表达载体pVAX1,将酶切、PCR、测序鉴定的阳性质粒经脂质体转染BHK-21细胞。通过SDS-PAGE、Western-blotting、间接免疫荧光法,检测细胞中B抗原的表达。【结果】琼脂糖凝胶电泳显示扩增的不同片段大小分别与预期的相同。重组表达载体转染BHK细胞后有荧光出现。表达的蛋白能被猪囊尾蚴病阳性血...
[期刊] 华北农学报
[作者]
吴国华 张强 颜新敏 侯俊玲 赵志荀 崔力凡 李健 朱海霞 朱彩珠
为了构建O型FMDVP1-2A基因与猪IFN-γ基因共表达质粒并在BHK-21细胞中进行表达,本研究利用聚合酶链式反应(PCR)从阳性质粒pGEM-P12A克隆到P1-2A基因,将扩增产物纯化、双酶切后连接到pBudCE-IFN载体,构建重组质粒pBudCE-IFN-P1-2A。重组表达质粒鉴定后,在脂质体介导下转染BHK-21细胞,用RT-PCR和直接免疫荧光试验分别检测P1-2A和IFN-γ在BHK-21细胞中的表达。RT-PCR检测显示,重组表达质粒转染细胞后P1-2A和IFN-γ基因成功转录出mRNA;免疫荧光试验表明目的基因在BHK-21细胞中获得了表达。结果证明,本研究成功构建了重...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
苏文强 胡鑫宇 王秋霞 欧长波 郭爱疆 李辉 骆学农 余燕 张艳红 姜金庆 刘兴友 马金友 王松 才学鹏
【目的】获得猪囊尾蚴凋亡蛋白酶抑制剂(API)基因在大肠杆菌中的最佳表达条件,为API功能研究奠定基础。【方法】以表达载体pEGX-4T-1、pET-30a及猪囊尾蚴API基因的原核表达载体pEGX-4T-1/API-Flag、pET-30a/API为材料,对影响API蛋白表达的载体(pEGX-4T-1、pET-30a)、温度(25,30,37℃)、诱导时间(2,4,6,8h)、IPTG终浓度(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mmol/L)和卡那霉素终浓度(100,200,300,400mmol/L
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘振勇 吕志慧 郑亚东 窦永喜 乔军 骆学农 张艳 景志忠 才学鹏
【目的】克隆、表达猪囊尾蚴dUTPase基因并分析其酶学活性。【方法】通过RT-PCR的方法克隆猪囊尾蚴dUTPase基因,将其与pET载体连接并在原核系统中高效表达;表达产物经Ni柱纯化后进行酶学活性测定。【结果】序列分析表明猪囊尾蚴dUTPase基因与六钩蚴的dUTPase基因核苷酸同源性为100%,而且其氨基酸序列中同样存在5个保守基序。SDS-PAGE显示在21kD附近出现与目的蛋白大小相符的特异条带,表达产物经纯化后dUTPase的含量为2.863mg·mL-1。酶学活性试验证实重组dUTPase能特异性降解dUTP,同时EDTA可以抑制dUTPase的活性;而Mg2+可以增强猪囊尾...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李靓如 张中庸 李万密 张京 马春燕 黎立 马云生 董志珍 哈斯 李建忠 吴秀云
采取猪囊尾蚴组织,经过体外培养已建立一株细胞系,命名为猪囊尾蚴 CC-97免疫细胞系.原代培养30d 形成单层细胞,以1:2分种率传代培养,相隔7d 传代一次,连传24次,历时8个月之久.细胞系由三肿类型细胞组成,以椭圆形细胞占优势,梨形、球形者数额略相等.放射自显影法测定细胞分裂、~3H-TdR 显示细胞生长指数,均证明细胞对数增殖期长达7d,细胞生长从12h 开始倍增分裂,第4,5天相继达到倍增分裂高峰,细胞增殖率达11倍,增效达6.32×10~6mL~(-1),细胞周期约32h,细胞系二倍体细胞为主,染色体
[期刊] 华北农学报
[作者]
王秋霞 张美英 张改平 王选年 宁长申 鲁琨 张龙现 菅复春
研究了培养基、温度、诱导时间I、PTG和氨苄青霉素终浓度以及诱导前后温度变化等不同条件对重组菌菌体生长和融合蛋白表达量的影响,以期获得猪囊尾蚴排泄分泌抗原(ES Ag)Ts8B1蛋白基因在大肠杆菌中的最大表达量。结果显示,使用TB培养基于37℃培养3 h后,采用终浓度为0.2mmol/L的IPTG和200mmol/L的氨苄青霉素在32℃过夜诱导培养,pGEX-6p-1/Ts8B1融合蛋白表达量最大,表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的33%。SDS-PAGE表明pGEX-6p-1/Ts8B1融合蛋白大小约为33 kDa,与预计的分子量大小一致,Western blot分析表明其能与猪囊尾蚴多克隆抗体...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
丁举静 何成华 刘俐君 马彦娜 张海彬
为了探讨脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)对体外培养仓鼠肾细胞(BHK-21)的线粒体膜电位及Bax和Bcl-2蛋白表达的影响,采用细胞培养、流式细胞术、免疫细胞化学染色等方法,研究DON对细胞早期凋亡率、线粒体膜电位及Bax和Bcl-2蛋白表达的变化。结果显示:不同浓度的DON均可诱导BHK-21细胞凋亡,各浓度组的凋亡率都显著高于对照组(P
[期刊] 华北农学报
[作者]
毕研丽 沈小燕 丛国正 刘湘涛 常惠芸 才学鹏
为研究口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因的分子生物学特性及定位,构建了3D基因真核表达载体pEGFP-3D,观察了3D在BHK-21细胞中的瞬时表达情况。从重组质粒pMD18-T-3D扩增到3D基因,与pGEM-T easy载体连接,将鉴定为阳性的重组质粒pGEM-3D与表达载体pEGFP-N1分别经BamHⅠ/HindⅢ酶切,进行定向亚克隆;重组表达质粒pEGFP-3D经PCR、酶切鉴定,阳性质粒进行测序。利用脂质体介导阳性pEGFP-3D质粒转染BHK-21细胞,免疫组化检测转染细胞中3D基因表达情况和3D基因在细胞中的定位,Western blotting验证pEGFP-3D融合基因的表达。...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
任珍珍 刘晶晶 柳晓磊 陈永 李珣 胡美英
【目的】探索重叠延伸PCR法在昆虫化学感受蛋白基因点突变上的应用,研究半胱氨酸(Cys32)对小菜蛾(Plutella xylostella)化学感受蛋白1(PlxyCSP1)结合特性的影响。【方法】用计算机软件模拟PlxyCSP1上Cys32突变前后的蛋白三级结构以及与配体化合物的结合情况,确定点突变位点。根据扩增得到的PlxyCSP1序列设计并合成重叠引物,利用重叠延伸PCR法,将PlxyCSP1上的Cys32突变成色氨酸(Trp32),获得突变体PlxyCSP1-M。将突变后的基因与载体pET-32a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)。【结果】分子对接图显示,配体可以顺利进入Pl...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
常正山 张永年 何显成 张永红 裘丽姝 方莹 朱显因 於永和 朱慧芬 陈平芳 林荣泉
猪囊尾蚴病目前仍是危害人体健康的重要寄生虫病。本实验探讨猕猴能否寄生猪囊尾蚴及其在猴体内的寄生数量、分布部位及临床表现,为临床诊治囊虫患者提供参考,为人畜囊虫免疫学、分子生物学的研究提供极宝贵的活体材料。分别给6只雄性猕猴人工定量(镜下计卵)接种猪带绦虫孕卵节片。生前用皮试酶标法检查,死后解剖,统计囊虫在不同解剖部位的寄生数目,并对部分猴用 MRI 对照检查脑部囊虫寄生部位与数目。人工感染猪带绦虫孕节的6只猕猴在相同的饲养管理条件下存活期有所不同(79～1299d).
[期刊] 华北农学报
[作者]
王秋霞 马景周 宁长申 张龙现 菅复春
利用纯化的猪囊尾蚴重组蛋白M13h作为抗原包被酶标板,通过棋盘滴定方法筛选最佳反应条件,初步建立了猪囊尾蚴病间接ELISA检测方法。确定最佳包被量为1μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,酶标二抗的稀释倍数为1∶1 000,二者的作用时间均为45 min;与猪弓形虫病、猪旋毛虫病、细颈囊尾蚴病、猪蛔虫病、包虫病阳性血清均不发生反应,且具有较好的重复性。为囊虫病的流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。
关键词：
猪囊尾蚴 M13h蛋白 间接ELISA
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
杨举 张西臣 尹继刚 何宏轩 李德昌 李建华
四月份以来,长春市暴发了多起猪急性死亡事件。患猪主要症状为:发热、食欲不振,减食或不食,两耳发紫,个别猪臀部发紫,重症猪于日内死亡.剖检可见肝脏肿大,表面有大量出血点和白色米粒样虫体寄生,腹腔有大量血色积液,并悬浮大量白色米粒样虫体,用手捞起虫体内眼可见乳白色头节.肝脏切面亦见有大量白色米粒样虫体.经解放军农牧大学寄生虫病学教研室诊断定为猪急性细颈囊尾蚴病,这是长春市首次发现的该病病例。患猪用驱绦灵注射液治疗一次后剖检病猪发现虫体死亡,其他用药猪于次日开始恢复正常.由于该病与猪食入犬泡状绦虫卵有关,因此敬告各养猪户,应严格杜绝猪食到犬粪和生的犬下水.
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
唐金花 吴力人 冯云
猪囊尾蚴病危害人、畜,是肉品检验的重点项目之一.有猪囊尾蚴的猪肉不能作鲜肉出售供食用,常造成巨大的经济损失,如1980年伊盟某单位为职工谋福利购进猪肉4 ,职工发现猪肉有异样,经检验认为是猪囊尾蚴,再进一步检验带虫肉占1/3,导致4t 肉全部焚烧,按当时市价估算每斤猪肉4元,损失人民币16000元.人感染猪囊尾蚴时,寄生在脑内可招致癫痫以致死亡,如东胜市刘某某在84年误食猪囊尾蚴,
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
武发菊 尚勇良 安芳兰 董文教 宋玉霞 董金杰 陈苗苗 牟克斌 黄银君 刘学荣
【目的】研究在幼仓鼠肾细胞(BHK-21)悬浮培养过程中,不同浓度氨对其生长代谢的影响。【方法】用添加0,1.8,2.5,5.5,8.0和15.0 mmol/L氨的培养基培养BHK-21细胞,每隔12 h取样1次,用细胞计数仪进行细胞计数,测定细胞活力,采用AO/EB双染色法和Annexin V-FITC/PI流式细胞仪2种方法检测细胞的凋亡情况,同时测定细胞培养过程中葡萄糖、氨和乳酸浓度的变化。【结果】在BHK-21细胞连续培养过程中,当氨的添加浓度低于1.8 mmol/L时,其对细胞的生长几乎不产生抑制作用,细胞活性、细胞总数与对照组差异不显著,未出现细胞聚集成团现象;当氨添加浓度达到15...
[期刊] 水产学报
[作者]
黄锋涛 熊海林 曹胜波 熊传喜 王敏 王卫民 吴兵 刘玉林 刘学芹
为构建基于杆状病毒表达系统的CCV新型亚单位疫苗,将CCV的囊膜蛋白基因ORF6克隆至杆状病毒转座载体pFastBacTM 1质粒中,并将阳性重组转座质粒转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得重组子rBacmid-ORF6。在脂质体介导下将该重组子转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒AC-ORF6。AC-ORF6感染的sf9昆虫细胞,经超薄切片电镜观察,可见重组杆状病毒呈多粒包埋,经间接免疫荧光、Western-blotting检测,CCV的ORF6蛋白可以在感染了AC-ORF6的sf9细胞中表达。研究表明,获得了插入ORF6基因的重组杆状病毒,并且该基因可以在重组杆状...
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